Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

Groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten worden veel gebruikt gereedschap voor het bestuderen van eiwit lokalisatie en dynamiek van evenementen zoals het cytoskelet remodeling en vesiculair transport in levende cellen. Kwantitatieve methoden gebruikt chimeer GFP-fusies zijn ontwikkeld voor vele toepassingen; echter GFP enigszins resistent tegen proteolyse, waardoor de fluorescentie blijft in het lysosoom / vacuole, die kwantificering van vracht handel kan belemmeren de endocytische route. Een alternatieve werkwijze voor het kwantificeren endocytose en post-endocytische handel gebeurtenissen maakt gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP dat wordt geblust in zure milieus. Chimère fusie van pHluorin aan de cytoplasmatische staart van transmembraan lading eiwitten leidt tot een demping van fluorescentie bij de oprichting van de lading in multivesiculaire lichamen (MVBs) en levering aan het lysosoom / vacuole lumen. Zo, het doven van vacuolaire fluorescentie vergemakkelijkt kwantificeringcatie van endocytose en het begin van de gebeurtenissen in de endocytische route. Dit artikel beschrijft methoden waarbij pHluorin gemerkte ladingen voor het kwantificeren van endocytose via fluorescentiemicroscopie en populatie gebaseerde assays met flowcytometrie.

Introduction

Vesiculair transport speelt een belangrijke rol bij het handhaven organel identiteit en functie in eukaryotische cellen, en is een belangrijk mechanisme voor het reguleren van eiwit en membraan samenstelling van individuele cellulaire compartimenten. Op het plasmamembraan, fusie van vesicles exocytose levert nieuwe eiwitten en membranen aan het oppervlak van de cel, terwijl vesicles gegenereerd door middel van endocytose membraan en eiwitten te verwijderen van het oppervlak voor daaropvolgende recycling of richten naar het lysosoom. Aldus endocytose is belangrijk voor nutriënten en reacties op de extracellulaire omgeving. Exocytose en endocytose zijn evenwicht te plasmamembraan oppervlakte te reguleren, en de omzet van de beschadigde eiwitten mogelijk te maken.

Studies in gist en zoogdiercellen zijn een groot aantal eiwitten die betrokken zijn endocytose, evenals meerdere endocytotische wegen die internalisatie specifieke ladingen bevorderen of die handeling vastgesteld in reactie op verschillende environmental omstandigheden. De best bestudeerde pathway is clathrine gemedieerde endocytose (CME), waarin clathrine en cytosolische additionele eiwitten assembleren tot een laag structuur de ontluikende endocytische vesicles stabiliseren. Experimenten in de gist Saccharomyces cerevisiae hebben belangrijke inzichten in de dynamiek en de volgorde van de werving voor vele endocytische eiwitten ^1-3 opleverde. Met name wordt de CME machine sterk geconserveerd door evolutie zodanig dat de meeste CME-gerelateerde eiwitten in gist hebben humane orthologen; dus, gist is een belangrijk instrument voor het begrip van de mechanismen van endocytose die zijn geconserveerd in hogere eukaryoten geweest. Bijvoorbeeld, studies met behulp van gist vastgesteld dat de vorming en rijping van CME structuren (als corticale actine vlekken in gist genoemd) omvat de sequentiële rekrutering van veel eiwitten, te beginnen met clathrine en-cargo bindende adapter eiwitten, gevolgd door de aanwerving van extra endocytische accessoire eiwitten,activering van Arp2 / 3-gemedieerde actine polymerisatie, en werving van eiwitten die betrokken zijn bij blaasje splitsing ^1,2. Aanwerving van CME machines eiwitten aan actine pleisters corticale is een sterk geordende en stereotiepe proces, en de precieze volgorde van de werving voor veel eiwitten is vastgesteld met betrekking tot andere onderdelen van de CME machines. Belangrijk is, hebben recente studies een vergelijkbare orde van werving voor CME eiwitten op-clathrine gecoate pits in zoogdiercellen ⁴ bevestigd.

Naast CME vele celtypen bezitten één of meer clathrine afhankelijke endocytose (CIE) pathways die afhankelijk zijn van alternatieve mechanismen vorming vesikel en internalisatie van het plasmamembraan ^5-7 promoten. In gist, hebben we onlangs geïdentificeerd een CIE traject dat de kleine GTPase Rho1 en het activeren van guanine nucleotide exchange factor (GEF), ROM1 ^8,9 gebruikt. Rho1 activeert de formin Bni1 om actine polymerisatie ¹ te bevorderen0,11, die nodig is voor deze vorm van clathrine afhankelijke endocytose in gist ^12. Bovendien, de α-arrestine eiwitfamilie rekruteren ubiquitine ligase Rsp5 om lading ubiquitinatie en daaropvolgende internalisering bevorderen door CME ^13-17, en ook bevorderen lading internalisatie via de CIE route, mogelijk door directe interactie met eiwitten die betrokken zijn CIE ^18. Verschillende CIE trajecten bestaan ook in zoogdiercellen, waaronder clathrine-onafhankelijke en fagocytische paden die afhankelijk zijn van de Rho1 ortholoog, RhoA ^9,19. De rol van RhoA in zoogdiercellen CIE is slecht begrepen; dus, kunnen studies in gist extra mechanistische inzichten die van toepassing zijn op zoogdieren CIE zijn te verstrekken.

Nauwkeurige kwantificering van endocytische gebeurtenissen kunnen belangrijke informatie over de rol van specifieke eiwitten bij het reguleren van endocytose te bieden, en kunnen de effecten van mutaties op de lading internalisatie of progressio onthullenn door de endocytische route. Hiertoe kan biochemische methoden worden toegepast om ligand opname controleren of snelheden van afbraak van eiwitten endocytische lading te meten. In levende cellen, fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten om ladingen van belang maakt directe visualisatie van vrachtvervoer. Echter, GFP ladingen hebben een beperkt nut voor het kwantificeren van endocytose omdat GFP is resistent tegen afbraak in het lysosoom (of vacuole in gist). Bovendien GFP fluorescentie slechts gedeeltelijk gevoelig voor veranderingen in pH en nog waarneembaar in de vacuole lumen ^20,21. Derhalve fluorescentie van het GFP-tag blijft in de vacuole lang nadat de rest van de lading is afgebroken en whole-cell kwantificering lading intensiteit onnauwkeurig zijn als gevolg van langdurige GFP fluorescentie in de vacuole.

Om de nadelen van vacuolaire GFP fluorescentie overwinnen we eerder gebruikt superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP die helder fluoresceert bij neutrale pH, maar verliest fluorescentie in zure omgevingen zoals het lumen van de vacuole / lysosoom ^20,22,23. Het plaatsen van een pHluorin tag op de cytoplasmatische staart van endocytische ladingen maakt visualisatie van de ladingen op het plasmamembraan en op de vroege endosomen, waar de pHluorin tag blijft blootgesteld aan het cytoplasma (Figuur 1A). Al in endosomen rijpen, de endosomale sorteren complex die nodig is voor het vervoer (ESCRT) machines pakketten-oppervlak gelokaliseerde ladingen in blaasjes die knop in het lumen van de endosoom, het genereren van multivesiculaire lichamen (MVBs) ^24. Voor ladingen die in de interne MVB blaasjes hebben opgenomen, de pHluorin tag kijkt in de richting van het blaasje lumen. Interne MVB blaasjes worden aangezuurd; dus pHluorin-gelabeld lading verliezen fluorescentie op de vroege endosomen als ze volwassen worden in MVBs ^20. Daaropvolgende fusie van het MVB de vacuole levert de inhoud MVB luminalevoor de afbraak, blijven en pHluorin labels geblust in het zure milieu van de vacuole lumen.

Dit document bevat gedetailleerde beschrijvingen van de kwantitatieve endocytische assays met behulp van ladingen met cytoplasmatische pHluorin labels in gist. Stammen die pHluorin-tag ladingen kunnen worden gebruikt in kinetische en / of eindpunt assays, afhankelijk van de eigenschappen en handel gedrag van de specifieke lading. Bovendien hebben sommige pHluorin-tag ladingen zijn vatbaar voor high-throughput analysemethoden, waaronder flowcytometrie. Belangrijk is dat de pHluorin tag is een veelzijdig instrument voor het bestuderen van endocytische gebeurtenissen in levende cellen, waardoor kwantificering van endocytose en vergelijking van endocytotische functie in het wild-type en mutante stammen.

Protocol

1. Oplossingen en Media Bereid de volgende bestanden, media en platen: 10x YNB bereiden, los 67 g gist basis van stikstof ontbreekt aminozuren in 1 liter water. Steriliseer door filtratie door een 0,22 urn nitrocellulosefilter. Bereid YNB medium met behulp van 1x YNB (van 10x voorraad) met 2% dextrose (van een steriele 50% w / v voorraad) en 1x aminozuur / nutriënt mengsel (van 100x voorraad, zie stap 1.1.4). Voor plasmideselectie, weglaten afzonderlijke aminozuren of nutriënten nodig. Vo…

Representative Results

Steady-state lokalisatie en kwantificering van de constitutief geïnternaliseerde endocytische cargo eiwit Ste3 Aantonen dat pHluorin gemerkte ladingen kan worden gebruikt voor het kwantificeren van endocytose in levende cellen, lokalisatie van chimeer GFP en pHluorin fusies met het C-eindstandige cytoplasmatische staart van Ste3, het a-factor feromoon receptor in gist, werden vergeleken. Ste3 is een G-eiwit g…

Discussion

Toepassingen van pHluorin voor het kwantificeren van endocytotische gebeurtenissen in gistcellen maakt gebruik van transmembraan ladingen waarin de fluorescente tag gefuseerd met de cytoplasmische staart van het eiwit (Figuur 1A). Voor de hier beschreven assays, ladingen zijn fel tl wanneer de pHluorin tag wordt blootgesteld aan neutrale omgevingen, maar worden gedoofd toen de pHluorin tag tegenkomt zure omstandigheden. Aldus wordt een pHluorin gemerkte endocytische lading gemakkelijk gedetecteerd bij h…

Materials

Adenine	Sigma	A8626-25G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)	BD	291920	Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Use for coating of chamber slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine	Acros	125121000	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine	Fisher	BP388-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan	Fisher	BP395-100	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine	Acros	140641000	Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)	Thermo Scientific	155411	Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil	Sigma	U0750-100G	Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens	Carl Zeiss		Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam	Cooke Corporation		Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source	Excelitas Technologies
Slidebook 5 software	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software	National Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/