Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes sont des outils largement utilisés pour étudier la localisation des protéines et la dynamique des événements tels que le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans les cellules vivantes. méthodologies quantitatives utilisant des fusions de GFP chimériques ont été développés pour de nombreuses applications; Cependant, la GFP est quelque peu résistant à la protéolyse, donc sa fluorescence persiste dans le lysosome / vacuole, ce qui peut nuire à la quantification du trafic de fret dans la voie endocytique. Une méthode alternative pour la quantification endocytose et post-endocytose événements de trafic utilise superecliptic pHluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui est trempé dans des environnements acides. fusion chimériques de pHluorin à la queue cytoplasmique de fret transmembranaire des protéines entraîne un amortissement de la fluorescence lors de la constitution de la cargaison dans des corps multivésiculaires (de MVBS) et la livraison à la lumière lysosome / vacuole. Ainsi, extinction de la fluorescence vacuolaire facilite quantification de l'endocytose et les événements précoces de la voie d'endocytose. Cet article décrit les méthodes utilisant des cargaisons pHluorin-marqués pour la quantification de l'endocytose par microscopie de fluorescence, ainsi que des analyses basées sur la population à l'aide de cytométrie en flux.
Introduction
le trafic vésiculaire joue un rôle important dans le maintien de l'identité et de la fonction des organites dans les cellules eucaryotes et est un mécanisme clé pour la régulation de la composition des protéines et de la membrane des compartiments cellulaires particuliers. À la membrane plasmique, la fusion des vésicules d'exocytose fournit de nouvelles protéines et les membranes à la surface de la cellule, tandis que les vésicules produites par endocytose retirer la membrane et des protéines de la surface pour un recyclage ultérieur ou le ciblage vers le lysosome. Ainsi, l'endocytose est importante pour l'absorption des nutriments et des réponses à l'environnement extracellulaire. Exocytose et endocytose sont équilibrés pour réguler la membrane plasmique de surface, et pour permettre le chiffre d'affaires des protéines endommagées.
Des études chez la levure et les cellules de mammifères ont identifié un grand nombre de protéines impliquées dans l'endocytose, ainsi que de multiples voies d'endocytose qui favorisent l'intériorisation de cargaisons spécifiques ou qui agissent en réponse à une variété de frconditions environnemen-. La voie la plus étudiée est la clathrine endocytose (CME), dans laquelle les protéines de clathrine et accessoires cytosolique assemblent en une structure de revêtement pour stabiliser la vésicule endocytaire naissante. Les expériences de la levure Saccharomyces cerevisiae ont donné des renseignements clés sur la dynamique et l' ordre de recrutement pour de nombreuses protéines d' endocytose 1-3. En particulier, le mécanisme de FMC est hautement conservée par l'évolution de telle sorte que la majorité des protéines liées à la FMC dans la levure ont orthologues humains; ainsi, la levure bourgeonnante a été un outil important pour les mécanismes d'endocytose qui sont conservés chez les eucaryotes supérieurs comprendre. Par exemple, des études utilisant des levures en herbe ont déterminé que la formation et la maturation des structures de FMC (appelée patches d'actine comme corticales dans la levure) implique le recrutement séquentiel de nombreuses protéines, en commençant par la clathrine et des protéines adaptatrices cargaison de liaison, suivi par le recrutement d'accessoire endocytose supplémentaire les protéines,activation de la polymérisation de l' actine Arp2 / 3 médiation et le recrutement de protéines impliquées dans des vésicules de scission 1,2. Le recrutement de protéines de machines de FMC à corticale patches d'actine est un processus très ordonné et stéréotypée, et l'ordre précis de recrutement pour de nombreuses protéines a été mis en place par rapport aux autres composants de la machinerie CME. Fait important, les études récentes ont confirmé un ordre similaire de recrutement pour les protéines de FMC à puits recouverts de clathrine dans les cellules de mammifères 4.
En plus de la FMC, de nombreux types de cellules possèdent un ou plusieurs endocytique (CIE) , les voies de clathrine indépendantes qui reposent sur des mécanismes alternatifs pour favoriser la formation de vésicules et l' intériorisation de la membrane plasmique 5-7. Chez la levure, nous avons récemment identifié une voie de CIE qui utilise la petite GTPase Rho1 et son guanine facteur d' activation d'échange nucléotidique (FEM), Rom1 8,9. Rho1 active le Formin Bni1 pour favoriser la polymérisation de l' actine 10,11, qui est requis pour cette forme de clathrine endocytose indépendante dans la levure 12. En outre, la famille des protéines α-arrestine recruter l'ubiquitine ligase Rsp5 pour promouvoir l' ubiquitination de la cargaison et intériorisation ultérieure par CME 13-17, ainsi que la promotion du fret intériorisation par la voie de la CIE, éventuellement par interaction directe avec les protéines impliquées dans la CIE 18. Une variété de voies CIE existent également dans les cellules de mammifères, y compris les voies de clathrine indépendant et phagocytaires qui comptent sur l'orthologue Rho1, RhoA 9,19. Le rôle de RhoA chez les mammifères CIE est mal comprise; ainsi, les études dans la levure en herbe peuvent fournir des indications mécanistes supplémentaires qui sont applicables à la CIE de mammifères.
Une quantification exacte des événements endocytose peut fournir des informations importantes sur les rôles des protéines spécifiques dans la régulation de l'endocytose, et peut révéler les effets des mutations sur l'intériorisation de la cargaison ou progression par la voie endocytique. A cet effet, les méthodes biochimiques peuvent être utilisées pour contrôler l'absorption du ligand ou de mesurer le taux de dégradation des protéines cargo endocytose. Dans les cellules vivantes, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes à cargaisons d'intérêt permet la visualisation directe de transport de fret. Toutefois, les cargaisons de GFP-tagged sont d'une utilité limitée pour la quantification de l'endocytose parce GFP est résistant à la dégradation dans le lysosome (ou vacuole dans la levure). Par ailleurs, la fluorescence de la GFP est seulement partiellement sensible aux variations du pH, et reste détectable au sein de la vacuole lumière 20,21. Par conséquent, la fluorescence de la balise GFP persiste dans la vacuole longtemps après le reste de la cargaison a été dégradée, et la quantification à base de cellules entières de l'intensité de la cargaison peuvent être inexacts en raison de long terme GFP fluorescence dans la vacuole.
Afin de pallier les inconvénients de la fluorescence vacuolaire de la GFP, nous avons précédemment fait usage de pH supereclipticluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui émet une fluorescence vive à pH neutre, mais il perd la fluorescence dans des environnements acides tels que la lumière de la vacuole / lysosome 20,22,23. Placer une balise pHluorin sur la queue cytoplasmique de cargaisons endocytose permet la visualisation des cargaisons à la membrane plasmique et sur endosomes précoces, où l'étiquette pHluorin reste exposée au cytoplasme (figure 1A). Comme endosomes précoces arrivent à maturité, le complexe de tri endosomal requis pour les paquets de transport (ESCRT) de machines cargos de surface localisée dans des vésicules qui bourgeonnent dans la lumière de l'endosome, générant corps multivésiculaires (MVBS) 24. Pour les cargaisons qui ont été incorporés dans les vésicules MVB internes, la balise pHluorin tournée vers la lumière de la vésicule. vésicules MVB internes sont acidifiés; ainsi, cargos pHluorin-taggés perdent la fluorescence sur endosomes précoces comme ils mûrissent dans MVBS 20. fusion subséquente du MVB avec la vacuole fournit le contenu MVB luminalpour la dégradation, les étiquettes et pHluorin restent éteintes dans l'environnement acide de la lumière de vacuoles.
Ce document fournit des descriptions détaillées des analyses quantitatives en utilisant endocytose des cargaisons avec des étiquettes de pHluorin cytoplasmiques dans la levure. Souches exprimant pHluorin-cargos marqués peuvent être utilisés dans des essais cinétiques et / ou finaux, selon les propriétés et le trafic comportement de la cargaison spécifique. En outre, certains cargos pHluorin-marqués se prêtent à des méthodes d'analyse à haut débit, y compris de cytométrie de flux. Fait important, la balise pHluorin est un outil polyvalent pour l'étude des événements endocytose dans les cellules vivantes, permettant la quantification de l'endocytose et la comparaison de la fonction d'endocytose dans de type sauvage et des souches mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des applications de pHluorin pour la quantification des événements endocytose dans des cellules de levure fait usage de cargaisons transmembranaires , dans lequel le marqueur fluorescent est fusionnée à la queue cytoplasmique de la protéine (figure 1A). Pour les essais décrits ici, sont fluorescentes vives cargaisons lorsque la balise pHluorin est exposé à des environnements neutres, mais devenir éteint lorsque la balise pHluorin rencontre des conditions acides. Ainsi, une cargaison d'endoc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
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