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Biologie

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Published: October 23, 2016
doi:
10.3791/54587
, , , ,
1Department of Biology,The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences,Duquesne University

Summary

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Abstract

proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti sono ampiamente utilizzati strumenti per studiare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica di eventi come il rimodellamento del citoscheletro e il traffico vescicolare nelle cellule viventi. metodologie quantitative che utilizzano fusioni GFP chimerici sono stati sviluppati per molte applicazioni; tuttavia, GFP è un po 'resistente alla proteolisi, così la sua fluorescenza persiste nel lisosoma / vacuolo, che può ostacolare la quantificazione del traffico merci nella via endocitico. Un metodo alternativo per quantificare endocitosi e post-endocitosi eventi traffico fa uso di superecliptic pHluorin, una variante pH-sensibile GFP che viene raffreddato in ambienti acidi. la fusione chimerica del pHluorin alla coda citoplasmatica di transmembrana carico proteine ​​risultati in una attenuazione della fluorescenza al momento della costituzione del carico in corpi multivesicular (MVB) e la consegna al lume lisosomi / vacuolo. Così, tempra di fluorescenza vacuolare facilita quantificazione di endocitosi ed eventi precoci nella via endocitico. Questo documento descrive i metodi che utilizzano carichi pHluorin-tag per la quantificazione di endocitosi tramite microscopia a fluorescenza, così come saggi basati sulla popolazione citometria a flusso.

Introduction

traffico vescicolare svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'identità organello e funzione in cellule eucariotiche, ed è un meccanismo fondamentale di regolazione composizione proteica e la membrana dei singoli compartimenti cellulari. Alla membrana plasmatica, fusione delle vescicole esocitosi offre nuove proteine ​​e membrane alla superficie della cellula, mentre vescicole generati tramite endocitosi rimuovere la membrana e proteine ​​dalla superficie per il successivo riciclaggio o destinata al lisosoma. Così, endocitosi è importante per l'assorbimento dei nutrienti e risposte all'ambiente extracellulare. Esocitosi e endocitosi sono equilibrati per regolare la superficie della membrana plasmatica, e per consentire un fatturato di proteine ​​danneggiate.

Studi in lievito e cellule di mammifero hanno identificato un gran numero di proteine ​​coinvolte nella endocitosi, così come molteplici percorsi endocitosi che promuovono internalizzazione dei carichi specifici o che agiscono in risposta ad una varietà di encondizioni am-. Il percorso più studiato è clatrina mediata endocitosi (CME), in cui clathrin e accessori citosolico proteine ​​assemblano in una struttura cappotto per stabilizzare la vescicola endocitico nascente. Gli esperimenti in erba lievito Saccharomyces cerevisiae hanno prodotto conoscenze fondamentali nei confronti delle dinamiche e l'ordine di assunzione per molte proteine endocytic 1-3. In particolare, la macchina CME è altamente conservata attraverso l'evoluzione tale che la maggior parte delle proteine ​​CME-relativi a lievito ha ortologhi umani; in tal modo, il lievito è stato uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi di endocitosi che sono conservati in eucarioti superiori. Ad esempio, gli studi che utilizzano il lievito in erba hanno determinato che la formazione e la maturazione delle strutture ECM (denominato patch actina come corticali nel lievito) coinvolge il reclutamento sequenziale di molte proteine, a cominciare da clatrina e proteine ​​adattatrici cargo-binding, seguita da assunzione di accessorio endocytic supplementari proteine,attivazione di polimerizzazione actina Arp2 / 3-mediata, e l'assunzione di proteine coinvolte nella scissione delle vescicole 1,2. Assunzione di proteine ​​macchine ECM per corticale patch di actina è un processo altamente ordinato e stereotipata, e l'ordine preciso di reclutamento per molte proteine ​​è stato stabilito rispetto ad altri componenti del macchinario CME. È importante sottolineare che recenti studi hanno confermato un ordine simile di reclutamento per le proteine ECM ai box clathrin rivestite in cellule di mammifero 4.

Oltre al CME, molti tipi di cellule in possesso di uno o più endocitico (CIE) percorsi clatrina-indipendenti che si basano su meccanismi alternativi per promuovere la formazione di vescicole e interiorizzazione dalla membrana plasmatica 5-7. In lievito, abbiamo recentemente identificato un percorso CIE che utilizza la piccola GTPasi Rho1 e il suo fattore di attivazione guanina scambio nucleotide (GEF), Rom1 8,9. Rho1 attiva il Formin Bni1 di promuovere la polimerizzazione 10,11, che è richiesto per questa forma di endocitosi clatrina-indipendenti in lievito 12. Inoltre, la famiglia α-arrestina di proteine reclutare l'ubiquitina ligasi Rsp5 per promuovere carico ubiquitinazione e successiva interiorizzazione attraverso CME 13-17, e anche promuovere carico interiorizzazione attraverso la via CIE, possibilmente attraverso l'interazione diretta con le proteine coinvolte nel CIE 18. Una varietà di percorsi CIE esistono anche nelle cellule dei mammiferi, inclusi i percorsi clatrina-indipendenti e fagocitarie che si basano sul ortologo Rho1, RhoA 9,19. Il ruolo di RhoA in mammiferi CIE è poco conosciuta; in tal modo, gli studi in lievito in erba possono fornire approfondimenti meccanicistici aggiuntive che sono applicabili a CIE mammiferi.

quantificazione accurata di eventi endocitici può fornire informazioni importanti circa i ruoli di proteine ​​specifiche nella regolazione endocitosi, e può rivelare gli effetti delle mutazioni sul carico internalizzazione o progression attraverso la via endocitico. A tale scopo, metodi biochimici possono essere utilizzati per monitorare ligando assorbimento o misurare tassi di degradazione delle proteine ​​cargo endocitosi. Nelle cellule viventi, fusione di proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti per carichi di interesse permette la visualizzazione diretta del trasporto merci. Tuttavia, carichi GFP-tagged sono di uso limitato per la quantificazione di endocitosi perché GFP è resistente alla degradazione in lisosomi (o vacuolo nel lievito). Inoltre, GFP fluorescenza è solo parzialmente sensibile alle variazioni di pH, e rimane rilevabile all'interno del vacuolo lume 20,21. Di conseguenza, la fluorescenza del tag GFP persiste nel vacuolo molto tempo dopo il resto del carico è stato degradato, e tutta la quantificazione delle cellule a base di intensità di carico può essere impreciso a causa di fluorescenza GFP-lungo termine nel vacuolo.

Al fine di superare gli inconvenienti della vacuolare GFP fluorescenza, abbiamo in precedenza fatto uso di pH supereclipticluorin, una variante pH-sensibile GFP che brilla fluorescente a pH neutro, ma perde fluorescence in ambienti acidi, come il lume del vacuolo / lisosoma 20,22,23. Posizionamento di un tag pHluorin sulla coda citoplasmatica dei carichi endocitici consente di visualizzare i carichi a livello della membrana plasmatica e su endosomi precoci, in cui il tag pHluorin rimane esposta al citoplasma (Figura 1A). Come endosomi precoci maturano, il endosomal di ordinamento complessi necessari per i pacchetti di trasporto (ESCRT) macchine carichi superficie localizzata in vescicole che germogliano nel lume del endosome, generando corpi multivesicular (MVB) 24. Per carichi che sono stati incorporati in vescicole MVB interne, il tag pHluorin rivolta verso il lume vescicole. vescicole MVB interne sono acidificati; in tal modo, carichi pHluorin-taggate perdono fluorescenza su endosomi precoci man mano che maturano in MVB 20. la fusione successiva della MVB con vacuolo fornisce i contenuti MVB luminaleper la degradazione, tag e pHluorin rimangono spente nell'ambiente acido del lume vacuolo.

Questo documento fornisce descrizioni dettagliate di analisi quantitativa, utilizzando endocitici carichi con tag pHluorin citoplasmatici nel lievito. I ceppi esprimenti carichi pHluorin-marcati possono essere utilizzati in saggi cinetici e / o del computer, a seconda delle proprietà e traffico comportamento del carico specifico. Inoltre, alcuni carichi pHluorin-tag sono suscettibili di metodi di analisi high-throughput, tra cui citometria a flusso. È importante sottolineare che il tag pHluorin è uno strumento versatile per studiare eventi endocytic nelle cellule viventi, permettendo la quantificazione di endocitosi e confronto della funzione endocitico nel wild-type e mutanti.

Protocol

1. Soluzioni e supporti Preparare i seguenti stock, Media e piastre: Per preparare 10x YNB, sciogliere 67 g di base azotata di lievito priva aminoacidi in 1 L di acqua. Sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron nitrocellulosa. Preparare medio YNB usando 1x YNB (da 10x magazzino) con il 2% di destrosio (da una sterile 50% w / v magazzino) e miscela di aminoacidi 1x / nutrienti (da 100x magazzino, vedere il punto 1.1.4). Per la selezione plasmide, omettere singoli amino…

Representative Results

Localizzazione steady-state e la quantificazione del costitutivamente interiorizzato endocitico proteine cargo STE3 Per dimostrare che carichi pHluorin-tag possono essere utilizzati per la quantificazione di endocitosi in cellule viventi, localizzazione di GFP chimerico e fusioni pHluorin con la coda citoplasmatica C-terminale STE3, il recettore feromone un fattore in lievito, sono stati confrontati. STE3 è u…

Discussion

Applicazioni di pHluorin per la quantificazione degli eventi endocitosi in cellule di lievito fa uso di carichi transmembrana in cui il tag fluorescente viene fusa alla coda citoplasmatica della proteina (Figura 1A). Per i saggi qui descritte, carichi sono fluorescenti vivacemente quando il tag pHluorin è esposto ad ambienti neutri, ma diventano spenta quando il tag pHluorin incontra condizioni di acidità. Così, un carico endocitico pHluorin-tag è prontamente rilevata la faccia citoplasmatica della …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.

Materials

Adenine Sigma A8626-25G Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Bacto-agar Fisher BP1423-2 Use for preparation of plate media
BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) BD 291920 Use for preparation of liquid and plate media
Concanavalin A Sigma C5275-5MG Use for coating of chamber slides
Dextrose Fisher BP350-1 Use for preparation of liquid and plate media
L-Histidine Fisher BP382-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Leucine Acros 125121000 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Lysine Fisher BP386-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Methionine Fisher BP388-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tryptophan Fisher BP395-100 Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
L-Tyrosine Acros 140641000 Use for preparation of amino acid mixture
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) Thermo Scientific 155411 Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization
Uracil Sigma U0750-100G Use for preparation of amino acid mixture and stock solution
Axiovert 200 inverted microscope Carl Zeiss Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens Carl Zeiss Objective should be 100X, 1.4NA or higher
Sensicam Cooke Corporation Camera should have 12-bit or higher dynamic range
X-Cite 120PC Q Illumination Source Excelitas Technologies
Slidebook 5 software Intelligent Imaging Innovations
ImageJ software National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij/
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References

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Keywords: PHluorinEndocytosisVesicular TraffickingYeastFluorescence MicroscopyLive-cell ImagingQuantitative AnalysisKineticsHigh-throughput
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Citer Cet Article
Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O’Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (116), e54587, doi:10.3791/54587 (2016).
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