الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
المعهد الوطني لليماغيج الصحة هي قوية ومتاحة بحرية برمجيات معالجة الصور. يماغيج ديه خوارزميات شاملة تحليل الجزيئات التي يمكن استخدامها بشكل فعال لحساب الجزيئات البيولوجية المختلفة. عندما عد أعداد كبيرة من عينات من الخلايا، تقدم عدادة الكريات عنق الزجاجة بالنسبة لآخر. وبالمثل، عد الأغشية من المقايسات الهجرة / الغزو مع عداد خلية يماغيج المساعد، وإن كانت صحيحة، هو عمل استثنائي مكثفة، ذاتية، واشتهر عن التسبب في آلام الرسغ. لتلبية هذه الحاجة، قمنا بتطوير اثنين من الإضافات ضمن يماغيج للقيام بهذه المهمة الوحيدة للعدادة الكريات الآلي (أو حجم معروفة) وعد الخلايا الهجرة / الغزو. كل من الإضافات تعتمد على القدرة على اكتساب الميكروسكوب عالية الجودة مع الحد الأدنى من الخلفية. فهي سهلة الاستخدام والأمثل لفرز سريع وتحليل عينات كبيرة الحجم مع أدوات التحليل المدمج للمساعدة في معايرة التهم الموجهة إليه. من خلال الجمع بين المبدأ الأساسيالصورة من عداد الخليوي مع خوارزمية الفرز والعد بعد التحليل الآلي، وهذا يزيد كثيرا من السهولة التي المقايسات الهجرة يمكن ان يتم بدون أي خسارة من الدقة.
Introduction
في عد الخلايا في المختبر هو أسلوب الأساسية الهامة في مجموعة واسعة من تجارب زراعة الأنسجة. تحديد بدقة عدد الخلايا في الثقافة أمر ضروري لاستنساخ التجارب وتوحيد 1،2. عد الخلايا يمكن القيام بها يدويا باستخدام عدادة الكريات فضلا عن استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب الآلية، ولكل منها مزاياه وعيوبه 3،4،5. معظم الطرق الآلية للعد الخلايا تنتمي إلى واحدة من فئتين، تلك التي تستخدم مبدأ كولتر أو التدفق الخلوي. عدادات كولتر الاستفادة من خلايا المقاومة الكهربائية لتحديد عدد الخلايا والحجم. فهي سريعة ودقيقة وأرخص من أجهزة قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك، نادرا ما يتم استخدامها لعد الخلايا الوحيد نظرا لتكلفتها كبيرة بالمقارنة مع العد والفرز اليدوي 3. تدفق cytometers، من ناحية أخرى، هي مكلفة ولكن لديهم العديد من التطبيقات مثل عد الخلايا، وتحليل شكل خلايا، الحادي والعشرينructure وقياس الخلايا الداخلية علامات 4،5. تتوفر العديد من الشركات المصنعة للأجهزة التي تستخدم أي من هذين المبدأين. العد والفرز اليدوي هو في متناول اليد ولكن وقتا طويلا وتخضع للانحياز في حين تأتي الأساليب الآلي مع جزء من الوقت اللازم لالعد والفرز اليدوي ولكن باستخدام أجهزة باهظة الثمن 6.
إجراءات زراعة الخلايا الأخرى الشائعة هي في المقايسات خلية حركية المختبر، وهي هجرة الخلايا وغزو 7. وتستخدم الهجرة والغزو فحوصات عادة للتحقيق حركية الخلية والغزو ردا على استجابة الكيميائي. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم على نطاق واسع لدراسة التطور الجنيني، والتفريق، استجابة التهابية، والانبثاث من أنواع خلايا متعددة 7-11. الخلايا التي هاجروا أو غزو من خلال غشاء مسامي لفحص الهجرة يمكن أن يكون كميا بطريقتين مختلفتين. أولا، من خلال تلطيخ الخلايا مع صبغة الفلورسنت، التفكك جيئة وذهابام الغشاء، وتقدير باستخدام قارئ الفلورسنت 12. وجود قيود على هذا الأسلوب من تقدير هو أنه لا يوجد سجل يمكن الاحتفاظ بها في الأغشية وليس هناك احتمال لمزيد من التحليل 13. طريقة القياس الكمي الثاني هو لهاجر / الخلايا لتكون ثابتة وملطخة صبغة الفلورسنت أو أكثر شيوعا، مع الأصباغ الخلوي مثل البنفسجي وضوح الشمس، طولويدين صبغة زرقاء أو الهيماتوكسيلين غزا. ثم يتم كميا الخلايا يدويا باستخدام الصور المجهرية مقلوبة من هذه الأغشية وهي تستغرق وقتا طويلا مهمة جدا 12،13.
للتغلب على عيوب خلية العد والفرز اليدوي، وضعت اثنين من عدادات خلية الآلي موثوقة ودقيقة للتركيز خلية ولفحص الهجرة. وقد وضعت هذه الخوارزميات مكافحة خلية الآلي ليماغيج على النحو المساعد باستخدام لغة الكمبيوتر جافا أوراكل. يماغيج هو أداة معالجة الصور العامة وعلى نطاق واسع المستخدمة التي وضعها المعهد الوطني للهيئة التعليم العاليLTH (NIH) 14،15. وبالتالي، أكتب هذه الإضافات ليماغيج يسهل سهولة الاندماج في المجتمع البيولوجي.
أتمتة عد الخلايا يضمن إنتاجية عالية واستنساخ مقارنة العد والفرز اليدوي. على الرغم من أن البرامج والإضافات أخرى متاحة يمكن استخدامها لحساب تركيز الخلية من خلال تحليل الصور 5،16،17، خلية تركيز حاسبة المساعد سريع ويمكن أيضا التعامل مع التخفيفات من الخلايا والعلاجات. وعلاوة على ذلك، جميع النتائج والحسابات من هذه العدادات اثنين يمكن انقاذه وتصديرها. هي الأمثل الإضافات المذكورين في هذه الورقة لاستخدام على النقيض المجهر مرحلة لتصوير الخلايا الحية وحقل كبير للعرض (كامل القبض على غشاء) التصوير للأغشية الهجرة الفحص من خلال استخدام نطاق تشريح. هي متاحة بحرية للتحميل مع تعليمات التثبيت من الإضافات: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة، حل المشاكل، والقيود
طبيعة الأساليب الحسابية الآلي، وعلى وجه التحديد تلك التي تحليل الجزيئات، تستلزم القدرة الحسابية لتحديد هذه الجسيمات. ونتيجة لذلك، فإن دقة كلا حاسبة تركيز خلية والهجرة فحص العداد تعتمد مجورلي على …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
