כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
המכון הלאומי ImageJ של בריאות היא חבילת תוכנת עיבוד תמונה רבת עוצמה, זמין באופן חופשי. ImageJ יש אלגוריתמי ניתוח חלקיקים מקיפים אשר ניתן להשתמש בם ביעילות למנות חלקיקים ביולוגיים שונים. כאשר כותבים מספרים גדולות של דגימות תאים, hemocytometer מציג צוואר בקבוק בכל הנוגע לזמן. כמו כן, ספירת ממברנות מבחני הגירה / פלישה עם דלפק תא תוסף ImageJ, למרות מדויק, הוא עבודה באופן יוצא מן הכלל אינטנסיבי, סובייקטיבי, לשמצה בשל גרימת כאב בפרקי יד. כדי לתת מענה לצורך זה, פיתחנו שני תוספים בתוך ImageJ למשימה הבלעדית של hemocytometer אוטומטיות (או נפח ידוע) ועוד היד נטויה תא הגירה / הפלישה. שני תוספים להסתמך על היכולת לרכוש micrographs באיכות גבוהה עם רקע מינימלי. הם קלים לשימוש אופטימיזציה עבור ספירה וניתוח מהיר של מדגמים גדולים עם כלי ניתוח מובנים כדי לעזור כיול של ספירות. על ידי שילוב של עיקרון הליבהים של מונה סלולארי עם ניתוח אלגוריתם ספירה אוטומטי שלאחר ספירה, זה מגדיל מאוד את הקלות שבה מבחני הגירה יכולים להיות מעובד ללא כל אובדן של דיוק.
Introduction
בשנת ספירת תאים במבחנה היא טכניקה בסיסית חשובה במגוון רחב של ניסויים בתרבית רקמה. קביעת מספר התאים במדויק בתרבות חיונית שחזור ניסיוני 1,2 סטנדרטיזציה. ספירת תאים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות hemocytometer וכן באמצעות מגוון של שיטות אוטומטיות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם 3,4,5. רוב השיטות האוטומטיות ספירת תאים שייך לאחת משתי כיתות, אלה העושים שימוש עיקרון קולטר או cytometry זרימה. מונה קולטר לנצל התנגדות חשמלית תאים כדי לקבוע את מספר נייד וגודל. הם מהירים, מדויקים יותר זולים מאשר cytometers זרימה. עם זאת, הם משמשים לעתים נדירות עבור ספירת תאים רק בשל הניכר בעלויות שלהם לעומת ספירה ידנית 3. זרימת cytometers, מצד השני, הם יקרים, אבל יש להם יישומים רבים כגון ספירת תאים, ניתוח של צורת התאים, structure ותא פנימי למדידת סמני 4,5. מכונות המשתמשות אחד משני עקרונות אלה זמינות מיצרנים רבים. ספירה ידנית היא זולה אך זמן רב ובכפוף ההטיה בעוד בשיטות האוטומטיות לבוא עם חלק מן הזמן הדרוש הספירה הידנית אלא באמצעות 6 מכונות יקרות.
הליכים נפוצים תרבית תאים אחרים נמצאים מבחני תנועתיות תא במבחנה, כלומר, נדידת תאים ופלישה 7. מבחני הגירה ופלישה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תנועתיות התא הפולשנות בתגובה לתגובה chemotactic. בנוסף, הם נמצאים בשימוש נרחב ללמוד התפתחות עוברית, בידול, תגובה דלקתית, וגרורות של סוגי תאים מרובים 7-11. תאים שתהליך ההתפתחות שלהם היגרו או פלשו דרך הממברנה נקבובי של assay הגירה ניתן לכמת בשתי דרכים שונות. ראשית, על ידי צביעה את התאים עם צבע פלואורסצנטי, דיסוציאציה הלוך ושובמ הממברנה, וכימות באמצעות קורא פלורסנט 12. הגבלה של שיטה זו של כימות היא שאף שיא ניתן להיעזר של ממברנות ואין אפשרות לניתוח נוסף 13. שיטת הכימות השנייה עבור היגרו / פלש תא להיות קבוע מוכתם צבע פלואורסצנטי או יותר נפוץ, עם צבעי ציטולוגיה כגון סגול קריסטל, צבע כחול toluidine או hematoxylin; אז תאים לכמת באמצעות תמונות מיקרוסקופיות הפוכות ידני של הקרומים האלה אשר הוא משימה מאוד זמן רב 12,13.
כדי להתגבר על החסרונות של ספירת תאים ידנית, שני מוני תא אוטומטיים אמינים ומדויקים עבור ריכוז תא עבור assay הגירה פותחו. אלגוריתמים נגד תא אוטומטי אלו פותחו עבור ImageJ בתור תוסף באמצעות שפת מחשב Java של אורקל. ImageJ הוא כלי עיבוד תמונה ציבורי הנפוצה ביותר לשימוש שפותח על ידי המכון הלאומי של חימוםLTH (NIH) 14,15; וכך, כותב תוספים אלה עבור ImageJ מקל אינטגרציה קלה לתוך הקהילה הביולוגית.
אוטומציה של ספירת תאים מבטיחה תפוקת שחזור גבוהות לעומת ספירה ידנית. למרות תוכנות ותוספות אחרות זמינות שניתן להשתמש בם כדי לחשב ריכוז תא באמצעות ניתוח תמונת 5,16,17, תוסף מחשבון ריכוז תא הוא מהיר והוא יכול גם להתמודד עם דילולים של תאים וטיפולים. יתר על כן, כל התוצאות והחישובים משני מונים אלה ניתן לשמור וייצא. שני תוספים המתואר במאמר זה מותאמים לשימוש מיקרוסקופ לעומת שלב הדמיה תא חי ושדה גדול של תצוגה (לכידת הממברנה כולה) הדמיה עבור ממברנות assay הגירה באמצעות היקף הניתוחים. את התוספים זמינים באופן חופשי להורדה עם הוראות התקנה מ: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים, פתרון בעיות, ומגבלות
עצם טבעו של שיטות חישוביות אוטומטיות, במיוחד אלה של ניתוח חלקיקים, מחייבת היכולת המתמטית להגדיר חלקיקים אלה. כתוצאה מכך, את הדיוק של שני מחשבון נייד ריכוזיות דלפק assay ההגירה תלוי majorly על נאמנות תמ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
