Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
L'Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l'elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l'emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all'interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l'analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un'analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.
Introduction
Nel conteggio delle cellule in vitro è un'importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione 1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi 3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli sfruttano cellule resistenza elettrica per determinare il numero di cellule e le dimensioni. Sono veloci, accurati e più economico rispetto citometri a flusso. Tuttavia, essi sono raramente utilizzati solo per il conteggio delle cellule a causa del loro costo considerevole rispetto al conteggio manuale 3. Flusso citometri, d'altra parte, sono costosi ma hanno molte applicazioni, come il conteggio delle cellule, analisi della forma cellule, structure e cella di misura interna marcatori 4,5. Le macchine che utilizzano uno di questi due principi sono disponibili da molti produttori. Conteggio manuale è conveniente, ma richiede tempo e soggetto a bias mentre i metodi automatici sono dotati di una frazione del tempo richiesto per il conteggio manuale, ma utilizzando macchine costose 6.
Altre procedure di coltura cellulare comune ha de saggi di motilità cellulare in vitro, vale a dire, la migrazione cellulare e dell'invasione 7. saggi di migrazione e invasione sono comunemente usati per studiare la motilità cellulare e invasività in risposta ad una risposta chemiotattica. Inoltre, essi sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale, la differenziazione, la risposta infiammatoria, e le metastasi di più tipi di cellule 7-11. Le cellule che sono migrati o invaso attraverso la membrana porosa di un saggio di migrazione possono essere quantificati in due modi diversi. In primo luogo, colorando le cellule con un colorante fluorescente, dissociazione from la membrana, e la quantificazione usando un lettore di fluorescenza 12. Una limitazione di questo metodo di quantificazione è che nessun record può essere conservato delle membrane e non vi è alcuna possibilità per ulteriori analisi 13. Il secondo metodo di quantificazione è per migrato / celle da fissi e colorati con colorante fluorescente o più comunemente, con coloranti citologici, come violetto di cristallo, toluidina colorante blu o ematossilina invaso; quindi le cellule vengono quantificati utilizzando manualmente immagini microscopiche invertite di queste membrane che è un compito molto tempo 12,13.
Per superare gli inconvenienti di conteggio manuale delle cellule, sono stati sviluppati due contatori di cellule automatizzati affidabili ed accurate per concentrazione cellulare e per il dosaggio di migrazione. Questi algoritmi automatizzati contatore di cellule sono stati sviluppati per ImageJ come plugin usando il linguaggio del computer Java di Oracle. ImageJ è uno strumento di elaborazione immagine pubblica e diffuso sviluppato dal National Institute of Health (NIH) 14,15; in tal modo, scrivendo questi plugin per ImageJ facilita l'integrazione nella comunità biologica.
Automazione del conteggio delle cellule assicura un throughput elevato e riproducibilità rispetto al conteggio manuale. Anche se altri software e plug-in disponibili possono essere utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare attraverso l'analisi delle immagini 5,16,17, cellulare Concentrazione calcolatore di plug-in è veloce e può anche gestire diluizioni di cellule e trattamenti. Inoltre, tutti i risultati ei calcoli di questi due contatori possono essere salvati ed esportati. I due plugin descritti nel presente documento sono ottimizzate per l'impiego di un microscopio a contrasto di fase per l'imaging cellulare dal vivo e ampio campo di vista (cattura tutta la membrana) di imaging per membrane dosaggio migrazione attraverso l'uso di un ambito dissezione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni
La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell'immagine, cioè quanto strettamente l'immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
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