ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
건강의 ImageJ에 국립 연구소는 강력하고 자유롭게 사용할 이미지 처리 소프트웨어 제품군입니다. ImageJ에 다양한 생물학적 입자를 계산하기 위해 효과적으로 사용할 수있는 포괄적 인 입자 분석 알고리즘을 보유하고 있습니다. 세포 샘플들의 다수를 카운트하면 혈구 시간 관련하여 병목 현상을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 ImageJ에 플러그인 셀 카운터와 마이그레이션 / 침공 분석에서 막을 계산 정확하지만, 손목 통증을 일으키는 매우 노동 집약적 주관적인, 그리고 악명입니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 자동 혈구 (또는 알려진 볼륨) 및 마이그레이션 / 침략 세포 계수의 유일한 작업 ImageJ에 내 두 개의 플러그인을 개발했다. 두 플러그인 최소 배경 고품질 현미경 사진을 획득 할 수있는 능력에 의존한다. 그들은 사용하기 쉽고 카운트 교정에 도움 내장 된 분석 도구와 큰 샘플 크기의 빠른 계산과 분석에 최적화되어 있습니다. 핵심 원리를 결합하여자동화 된 계산 알고리즘 및 사후 분석 계산 셀 카운터 (S)이 크게 이동 분석 정확도의 손실없이 처리 될 수있는 용이성을 증가시킨다.
Introduction
시험 관내 세포 카운트에서 조직 배양 실험의 넓은 범위의 중요한 기본 기술이다. 정확하게 배양 세포의 수를 결정하는 실험 재현성 표준화 1,2- 필수적이다. 세포는 혈구 계산을 사용뿐만 아니라 자동화 된 방법의 다양한 고유의 장점과 단점 3,4,5- 각을 사용하여 수동으로 수행 될 수있다. 세포 계수에 대한 자동화 된 방법의 대부분은 두 개의 클래스, 콜터 원리를 사용하거나 유동 세포 계측법이 그 중 하나에 속한다. 콜터 카운터는 세포 수와 크기를 결정하기 위해 셀의 전기 저항을 이용한다. 이들은 유동 세포 계측기보다 빠르고 정확하고 저렴하다. 그러나, 이들은 거의 수동 계산 3 비교 인해 상당한 비용 만 세포 카운팅에 사용되지 않는다. 한편, 세포 계측기 흐름 비싸다 있지만 휴대 계산, 셀 형상, 명세서의 분석과 같은 많은 응용 분야를 가지고ructure 측정 내부 셀은 4,5 마커. 이 두 원칙 중 하나를 사용 기계는 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 자동화 된 방법은 수동 계산에 필요한 시간의 일부와 함께하지만 비싼 기계 (6)을 사용하는 동안 수동 계산은 저렴하지만 시간과 바이어스의 적용을받습니다.
다른 일반적인 세포 배양 과정은 시험 관내 세포 운동성 분석, 즉, 세포 이동 및 침입 7이다. 마이그레이션 및 침략 분석은 일반적으로 화학 주성 응답에 대한 응답으로 세포 운동성 및 침입을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, 이들은 널리 여러 세포 유형 7-11 배아의 발달, 분화, 염증성 반응 및 전이를 연구하기 위해 사용된다. 마이그레이션 분석의 다공질 막을 통해 이전 또는 침입 한 세포는 두 가지 방법으로 정량화 될 수있다. 첫째, 형광 염료로 염색 세포를 해리하여 이리저리형광 판독기 (12)를 사용하여 막 및 정량화 해요. 정량이 방법의 제한은 기록 막의 유지 될 수 없으며 추가 분석 13 가능성이 없다는 것이다. 마이그레이션에 대한 두 번째 정량 방법은 / 고정 및 크리스탈 바이올렛, 톨루이딘 블루 염색 또는 헤 마톡 실린과 같은 세포 학적 염료와 더 일반적으로 형광 염료, 염색되는 세포를 침공된다 그 다음 세포는 수동으로 매우 시간이 걸리는 작업 12,13 이들 막의 반전 현미경 이미지를 사용하여 정량화된다.
수동 세포 계수의 단점을 극복하기 위해, 세포 농도 및 마이그레이션 분석을위한 두 신뢰성 있고 정확한 자동 세포 계수기가 개발되었다. 이러한 자동 세포 계수기 알고리즘 오라클 자바 컴퓨터 언어를 사용하여 플러그인으로 ImageJ에 대해 개발되었다. ImageJ에는 난방 국립 연구소에서 개발 한 공공 및 널리 사용되는 이미지 처리 도구입니다l 번째 (NIH) 14, 15; 따라서, ImageJ에 이러한 플러그인을 작성하는 것은 생물학적 지역 사회에 쉽게 통합을 용이하게합니다.
세포 계수의 자동화는 수동 계산에 비해 높은 처리량과 재현성을 보장합니다. 다른 가능한 소프트웨어 및 플러그인은 이미지 분석 5,16,17, 세포 농도 계산기 플러그인을 통해 세포 농도를 계산하기 위해 사용될 수 있지만 고속이며 또한 세포 치료의 희석 처리 할 수있다. 또한,이 두 카운터에서 모든 결과 및 계산을 저장하고 내보낼 수 있습니다. 이 논문에서 설명 된 두 개의 플러그인 해부 범위의 사용을 통해 생균 이미징 마이그레이션 분석 멤브레인 큰 시야 (전체 막 캡처) 이미징 위상차 현미경의 사용을 위해 최적화된다. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins : 플러그인은에서 설치 지침을 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요한 단계, 문제 해결 및 제한 사항
자동화 된 계산 방법의 특성상 입자 분석의 상세들은, 이들 입자를 정의하는 수학적인 기능을 필요로한다. 따라서, 세포 농도 계산기 마이그레이션 분석 계수기 모두의 정확도는 상기 캡쳐 된 이미지는 세포 샘플 또는 마이그레이션 분석 막과 유사한 방법에 가깝게, 즉 이미지 충실도 majorly에 의존한다. 따라서 가능한 한 가장으로 현미경 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
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