ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
健康のImageJの国立研究所は、強力な、自由利用可能な画像処理ソフトウェアスイートです。 ImageJのは、様々な生物学的粒子をカウントするために有効に利用することができる総合的な粒子解析アルゴリズムを有します。セルの多数のサンプルをカウントすると、血球計数器は、時間に関してボトルネックを提示します。同様に、ImageJのプラグインセルカウンターで移行/浸潤アッセイからの膜を数え、正確なものの、非常に労働集約的主観、および手首の痛みを引き起こすための悪名高いです。このニーズに応えるために、我々は、自動血球計数器（または知られているボリューム）と移行/浸潤細胞計数の唯一のタスクのためのImageJ内の2つのプラグインを開発しました。どちらのプラグインは、最小限の背景に高品質の顕微鏡写真を取得する能力に依存します。彼らは、使いやすいとカウントのキャリブレーションを支援する組み込みの分析ツールを持つ大規模なサンプルサイズの迅速な計数および分析のために最適化されています。コア原理を組み合わせることにより自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析による細胞カウンタのsが、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。
Introduction
インビトロでの細胞計数では、組織培養実験の広い範囲の重要な基本的な技術です。正確に培養物中の細胞の数を決定する実験の再現性および標準化の1,2のために不可欠です。細胞計数は、血球計を用いて、ならびに自動化された方法の様々な独自の利点と欠点3,4,5でそれぞれを使用して手動で行うことができます。細胞計数のための自動化された方法のほとんどは、2つのクラス、コールター原理を使用するか、フローサイトメトリーもののいずれかに属しています。コールターカウンターは、細胞数およびサイズを決定するために、セルの電気抵抗を利用します。彼らは、高速で正確かつフローサイトメーターよりも安くなっています。しかし、彼らはほとんどマニュアルカウント3に比べて、それらのかなりのコストにのみ細胞計数のために使用されていません。フローサイトメーターは、一方で、高価であるが、それらは、細胞計数、細胞形状の解析、STのような多くの用途を有しますructureと内部細胞マーカーに4,5を測定します 。これら2つの原則のいずれかを使用するマシンは、多くのメーカーから入手可能です。自動化された方法は、手動計数のために必要な時間の一部が付属していますが、高価なマシン6を使用しながら手動カウントが手頃な価格が、時間がかかり、バイアスの対象となります。
他の一般的な細胞培養手順は、細胞遊走および浸潤7、すなわち、 インビトロ細胞運動性アッセイです 。遊走および浸潤アッセイは、一般的走化性応答に応答して細胞運動性および侵襲性を調査するために使用されます。さらに、それらは、広く多様な細胞型7-11の胚発生、分化、炎症反応、および転移を研究するために使用されます。遊走アッセイの多孔質膜を通って遊走または浸潤した細胞は、2つの異なる方法で定量することができます。あちこちまず、蛍光色素で細胞を染色することにより、解離蛍光リーダ12を用いて膜、および定量化をメートル。定量化のこの方法の制限は、レコードが膜を保持することができない、さらなる分析13のための可能性がないということです。第二の定量法は、クリスタルバイオレット、トルイジンブルー染料またはヘマトキシリンなどの細胞学的染料で、より一般的に蛍光色素またはで固定し、染色する浸潤/遊走した細胞のためのものです。次いで、細胞を、手動で、非常に時間のかかる作業12,13でこれらの膜を倒立顕微鏡画像を使用して定量します。
手動細胞計数の欠点を克服するために、細胞濃度および移動アッセイのための2つの信頼できる正確な自動細胞カウンターを開発しました。これらの自動化されたセルカウンタアルゴリズムは、OracleのJavaコンピュータ言語を使用してプラグインとしてImageJのために開発されました。 ImageJがょんの国立研究所によって開発された公開と広く使用されている画像処理ツールです。LTH（NIH）14,15;このように、ImageJのためにこれらのプラグインを書くこと生物群集への容易な統合を容易にします。
細胞計数の自動化は、手動カウントに比べて高いスループットと再現性を保証します。他の利用可能なソフトウェアやプラグインは、画像解析5,16,17、細胞濃度計算プラグインを介して細胞濃度を計算するために使用することができるが、高速であり、また、細胞および治療の希釈物を処理することができます。また、これら2つのカウンタからのすべての結果と計算が保存され、エクスポートすることができます。このホワイトペーパーで説明する2つのプラグインは、解剖スコープを使用することにより、生細胞イメージングおよび遊走アッセイ膜のための大きな視野（膜全体のキャプチャ）イメージング用の位相差顕微鏡の使用に最適化されています。 http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins：プラグインはからのインストール手順とダウンロードのために自由に利用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
重要なステップ、トラブルシューティング、および制限
自動化された計算方法の性質上、粒子解析の特にそれらは、これらの粒子を定義するための数学的能力を必要とします。その結果、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタの両方の精度が撮影した画像は、細胞試料または遊走アッセイ膜に似ているつまり、どのように密接に、画像の忠実度にすぎなかっ依存して…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
