Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

Abstract

L'Institut national de ImageJ de santé est un puissant disponible gratuitement suite logicielle, de traitement d'image. ImageJ dispose d'algorithmes complets d'analyse de particules qui peuvent être utilisés efficacement pour compter diverses particules biologiques. Lorsque l'on compte un grand nombre d'échantillons de cellules, le hémocytomètre présente un goulot d'étranglement en ce qui concerne le temps. De même, le comptage des membranes à partir d'essais de migration / invasion avec le plug-in ImageJ compteur de cellules, bien que précise, est le travail exceptionnellement intensive, subjective, et infâme pour causer des douleurs au poignet. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé deux plugins au sein de ImageJ pour la seule tâche de hémocytomètre automatique (ou volume connu) et la migration / invasion cellulaire comptage. Les deux plugins reposent sur la capacité d'acquérir des micrographies de haute qualité avec un fond minimal. Ils sont faciles à utiliser et optimisé pour le comptage rapide et l'analyse des échantillons de grande taille avec des outils d'analyse intégrés pour aider à l'étalonnage des comptages. En combinant le principe de bases de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision.

Introduction

Dans le comptage des cellules in vitro est une technique de base importante dans une large gamme d'expériences de culture tissulaire. Déterminer avec précision le nombre de cellules dans une culture est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et la normalisation ^1,2. Le comptage des cellules peut être effectuée manuellement en utilisant un hémocytomètre ainsi que l' utilisation d' une variété de méthodes automatisées, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients ^3,4,5. La plupart des méthodes automatisées pour le comptage des cellules appartiennent à l'une des deux classes, ceux qui utilisent le principe de Coulter ou de cytométrie de flux. compteurs Coulter profitent de cellules résistance électrique afin de déterminer le nombre de cellules et la taille. Ils sont rapides, précis et moins coûteux que les cytomètres de flux. Cependant, ils sont rarement utilisés que pour le comptage des cellules en raison de leur coût considérable par rapport au comptage manuel ^3. Cytomètres de flux, d'autre part, sont chers, mais ils ont de nombreuses applications telles que le comptage des cellules, l'analyse de la forme des cellules, de structure et la cellule de mesure interne marqueurs de ^4,5. Les machines qui utilisent l'une de ces deux principes sont disponibles auprès de nombreux fabricants. Comptage manuel est abordable , mais beaucoup de temps et sujettes à des biais tandis que les méthodes automatisées viennent avec une fraction du temps nécessaire pour le comptage manuel , mais en utilisant des machines coûteuses ^6.

D' autres procédés de culture de cellules communes sont tests in vitro de la motilité cellulaire, à savoir, la migration cellulaire et l' invasion ^7. Migration et l'invasion des tests sont communément utilisées pour étudier la motilité cellulaire et l'invasivité en réponse à une réponse chimiotactique. En outre, ils sont largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire, la différenciation, la réponse inflammatoire, et les métastases de plusieurs types de cellules ^7-11. Les cellules qui ont migré ou envahies à travers la membrane poreuse d'un test de migration peuvent être quantifiés de deux façons différentes. En premier lieu, par coloration des cellules avec un colorant fluorescent, de la dissociation from la membrane et la quantification en utilisant un lecteur de fluorescence ^12. Une limitation de cette méthode de quantification est qu'aucun enregistrement peut être retenu des membranes et il n'y a aucune possibilité pour une analyse ultérieure ^13. La deuxième méthode de quantification est pour la migration / cellules à fixées et colorées par un colorant fluorescent ou plus communément, avec des colorants cytologiques tels que le cristal violet, toluidine colorant bleu ou hématoxyline envahi; puis les cellules sont quantifiées manuellement à l' aide des images microscopiques inversées de ces membranes qui est une tâche de longue haleine très ^12,13.

Pour pallier les inconvénients de comptage manuel des cellules, deux marqueurs fiables et précises cellules automatisées pour la concentration des cellules et pour l'essai de migration ont été développés. Ces contre algorithmes cellulaires automatisés ont été développés pour ImageJ comme un plugin Java en utilisant l'ordinateur de la langue d'Oracle. ImageJ est un outil de traitement d'image publique et largement utilisé développé par l'Institut national de Heanté (NIH) ^14,15; ainsi, l'écriture de ces plugins pour ImageJ facilite l'intégration dans la communauté biologique.

L'automatisation de comptage de cellules assure un débit élevé et la reproductibilité par rapport à un comptage manuel. Bien que d' autres logiciels et plugins disponibles peuvent être utilisées pour calculer la concentration de cellules par analyse d'image ^5,16,17, Concentration cellulaire Calculatrice plug - in est rapide et peut également gérer des dilutions de cellules et de traitements. En outre, tous les résultats et les calculs de ces deux compteurs peuvent être enregistrés et exportés. Les deux plugins décrits dans le présent document sont optimisés pour l'utilisation d'un microscope à contraste de phase pour l'imagerie des cellules vivantes et un grand champ de vision (ensemble de capture de la membrane) imagerie pour les membranes d'essai de migration à travers l'utilisation d'un champ de dissection. Les plugins sont disponibles gratuitement en téléchargement avec des instructions d'installation à partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

Microscope 1. Composé et configuration de la caméra (Calculatrice de concentration cellulaire)

1. Augmenter ampoule luminosité complète avec le bouton de réglage de la lumière, passer à l'objectif 4X, et assurer les filtres de contraste de phase sont sélectionnés.
   NOTE: Tout inversé microscope à contraste de phase pour la culture de tissus avec un fond sombre, par exemple, PhP contraste de phase, peuvent être utilisés suivant les procédures de microscope et de la caméra standard.
2. Dans le logiciel du microscope, définir les paramètres de capture d'image aux valeurs par défaut.
   REMARQUE: Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour trouver l'emplacement de ces paramètres.
   1. Set 'éclat »,« contraste »et« saturation »à 100% et« gamma »et« gain »de 1,0.
      REMARQUE: Selon le logiciel, «luminosité» et «contraste» peut par défaut à une valeur de 0% au lieu de 100%.
   2. Set de capturer des images en noir et blanc en utilisant la plus haute résolution available (1600 x 1200 pixels (px) ou plus).
      NOTE: Une «saturation» de 0% est suffisant si un cadre noir et blanc est indisponible.
3. Placez un hémocytomètre norme sur la platine du microscope et capturer une image telle que représentée sur (figure 1A); ceci est «l'image du volume d'étalonnage». Ajuster le calendrier d'exposition au besoin.

2. image Volume Calibration

1. Ouvrir ImageJ et dans le menu Plugins, démarrer la calculatrice cellule de concentration (CCC) de plugin, par exemple, Plugins> Analyzer> 'Calculator cellule de concentration ».
   1. Si le panneau du côté droit "Volume d'image Calibration 'est pas visible, cliquez sur« Calibrer »pour le montrer.
2. Dans ImageJ, ouvrez le «image d'étalonnage du volume" de l'étape 1.3 ( "Fichier"> "Ouvrir") et CCC, cliquez sur le bouton 'Get image Dimension'.
   NOTE: Cela remplira à la fois Largeur de l'image etzones de texte de la hauteur avec la résolution d'image en pixels automatiquement.
3. Dans ImageJ, sélectionnez l'option 'outil Ligne droite' à côté des outils de sélection et de tracer une ligne droite sur toute la longueur de l'hémocytomètre primaire (P) -carré démontré (figure 1B) en cliquant et en faisant glisser le curseur.
   1. Appuyez sur la touche «M» pour afficher la fenêtre des résultats contenant les mesures de ligne droite. Tapez la valeur de la colonne de longueur dans le 'P-carré Longueur' textbox en CCC (figure 1B).
   2. Cliquez sur le bouton 'Calculer volume Image' à la sortie du volume d'image dans le champ de volume d'image. Alternativement, si le volume de l'image est déjà connu, tapez le volume nL dans le champ du volume d'image.
4. Cliquez sur le bouton «Enregistrer».
   NOTE: Le plugin est maintenant calibré.

Exposition Calibration 3. Caméra

1. Après la récolte des cellules pourcomptage par hémocytomètre, charge 10 pi de cellules dans une chambre de l'hémocytomètre et le placer sur la platine du microscope.
2. En utilisant les mêmes paramètres de l'étape 1.2, régler le temps d'exposition de sorte que les lignes de la hémocytomètre de fond disparaissent.
   1. Ajuster la mise au point de sorte que l'intérieur des cellules est plus foncée que la membrane cellulaire, ce qui indique mise au point à l'intérieur de la section transversale centrale de la cellule et non pas des pôles.
   2. Ajuster en outre l'exposition de sorte que les cellules ne sont pas surexposés et ressemblent à celles représentées sur la (figure 1C).
      NOTE: Les lignes de hémocytomètre légèrement visibles sont acceptables. Il est recommandé d'enregistrer ou d'enregistrer ces paramètres pour maintenir la précision et la reproductibilité.

4. Image Acquisition

1. Pour chaque échantillon de cellules, charge 10 pi dans les deux chambres du hémocytomètre pour augmenter l' inférence statistique puissance ^2. Placer le hémocytomètre sur la platine du microscopepour l'imagerie.
   REMARQUE: La résolution et le grossissement de chaque image doit être le même que «l'image de calibration du volume». Le plugin compte toutes les images de tout dossier sélectionné; garder les images pour être comptées ensemble dans le même dossier.
   1. Si une fonction d'incrémentation automatique de nom de fichier est disponible, allumez-le et assurez-vous que chaque image est pas représenté après la capture pour augmenter le débit.
      REMARQUE: manuellement l'enregistrement et la fermeture de chaque image va considérablement ralentir le processus. Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour obtenir des informations sur la disponibilité d'une fonction d'auto-incrémentation.
   2. Capturez au moins trois images non-chevauchement de la région centrale de l'hémocytomètre bien plus (5-10) est recommandée pour augmenter la précision.
      REMARQUE: Éviter le dessus et les zones inférieures des chambres que les cellules ont tendance à augmenter la densité aux deux endroits. Prenez le même nombre d'images pour chaque chambre. Cela est nécessaire pour le bon fonctionnement du plug-in pendant le comptage.

   5. Comptage et Dilutions image

   1. En CCC, cliquez sur "Count cellules" et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez un dossier pour être compté.
   2. Observez la zone de saisie du numéro d'échantillon après avoir sélectionné un dossier. Entrez le nombre d'images prises par chambre, soit, 4.1.2, et cliquez sur 'Ok'. Le plugin va maintenant compter tous les jpg, tiff, et des images de png dans le dossier sélectionné dans l'ordre alphabétique.
      NOTE: En cliquant sur le bouton 'Viewer Sample' fera apparaître la fenêtre de la visionneuse d'échantillons affichant des informations sur les échantillons comptés. la concentration des échantillons est la concentration moyenne de toutes les images prises par chambre. Des échantillons avec des concentrations sans unité peuvent être ajoutés à cette liste, comme l'ajout d'un médicament ou une petite molécule traitement.
      1. Recount les échantillons de cellules si les concentrations varient de manière significative dans les comptes des mêmes échantillons (section 4).
         REMARQUE: Pour calculer les dilutions pour tout til comptait-échantillons, la CCC utilise automatiquement la formule C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Utilisez le scénario de l'ensemencement de 15.000 cellules par 200 ul dans 30 puits d'une plaque à 96 puits + 1 supplémentaire:
      1. Réglez le champ à droite de l'étiquette de C2 à 15.000 et le volume textbox de concentration à 200, en changeant l'unité de zone de liste déroulante à côté de 'ul'.
         NOTE: Le plugin sera finalement calculer la concentration dans les cellules / mL.
      2. Assurez-vous que la zone de liste déroulante de volume a V2 sélectionné (volume final) et dans la zone de texte à la droite entre 6200 (200 pi x (30 + 1)), en sélectionnant «ul» dans la zone de liste déroulante de l'unité de volume.
   4. Cliquez sur «Calculer Dilution» pour ajouter la dilution actuellement entré à la zone de liste en bas à gauche.
      NOTE: Pour chaque dilution supplémentaire, seront résolus pour chaque échantillon et affichées dans le diagramme d'arbre à droite. Double-cliquez sur chaque entrée pour se développer.
   5. Cliquer sur til bouton 'Enregistrer' sous le bouton 'Viewer Sample' écrire à déposer toutes les données et les dilutions d'échantillon.
   6. NOTE: Ces données peuvent être récupérées à tout moment en cliquant sur "Load" et en sélectionnant le fichier enregistré.

   6. Migration et Invasion (Counter)

   1. Effectuer les essais de migration et d' invasion en utilisant la méthode de la chambre de Boyden norme ^7-9.
   2. Après que les cellules ont migré / envahi, retirez soigneusement les médias au sein de l'insert en inversant et en tapotant doucement. Wick loin des médias en excès ont adhéré au fond de la membrane en touchant le bord d'une serviette en papier.
      NOTE: Ne touchez pas la membrane elle-même à la serviette, cela peut déloger les cellules adhérentes.
   3. Fixer et colorer les cellules comme rapporté ^7-9 dans une plaque de 24 puits mis en place avec chaque rangée contenant ~ 500 ul d'une solution différente, par exemple, fixatif, Teinté 1, Teinté 2, et de l' eau distillée deux fois (ddH ₂ O). Remplir une seconde plaque avec PBS 1x to placer les inserts en avant de couper.
   4. Laver les inserts en les plaçant dans des puits remplis de ddH ₂ O et remplir l'insert avec ddH ₂ O. Videz l'eau avant pistonnage élimine les cellules par inversion.
   5. Utilisez un coton propre pour éliminer les cellules non migrés / non envahie par le haut de la membrane en prenant soin de ne pas endommager la membrane. Être complet autour des bords de la membrane.
   6. Couper la membrane à l'aide d'un rasoir ou un scalpel et transférer soigneusement la membrane (côté fond vers le haut) sur une lame de verre propre.
   7. Ajouter une petite goutte de solution de montage au-dessous et au-dessus de la membrane et recouvrir d'une mince couverture de glissement.
      REMARQUE: Évitez de piéger des bulles au sein de la solution de montage pour préserver l'exactitude des chiffres.

   7. Dissection Portée et Caméra Setup

   1. Allumez la source et la caméra lumière du microscope.
      REMARQUE: Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour obtenir des instructions détaillées.
   2. Esprithin logiciels, définir les paramètres de capture d'image du microscope aux valeurs par défaut.
      REMARQUE: si une fonction d'étalement existe, une valeur de quatre est recommandée. Ceci est un bon compromis entre le degré de la moyenne et l'acquisition de l'image du temps. De même, un faible degré de netteté peut augmenter la fidélité des images.
      1. Set 'éclat »,« contraste »et« saturation »à 100% et« gamma »et« gain »de 1,0.
         REMARQUE: Selon le logiciel, «luminosité» et «contraste» peut par défaut à une valeur de 0% au lieu de 100%.
      2. Réglez l'affichage (en temps réel) et la résolution de capture à leurs valeurs maximales (1600 x 1200 px et 2.592 x 1.944 px, respectivement).
         NOTE: Résolution de l'écran peut être ajustée selon les besoins, si le taux de rafraîchissement est trop lent. Des résolutions plus faibles, il sera plus difficile de se concentrer avec précision, mais augmenter le taux de rafraîchissement.
   3. Pour l'étape de la portée de dissection, utiliser un backgro solide blancund; un fond noir ou en verre est insuffisante.
   4. Utilisez la source de lumière au-dessus-étape, de préférence de deux lumières flexibles LED à droite et à gauche de la scène.
      NOTE: Un dessous-stade source de lumière va éclairer les pores dans la membrane de test de migration qui peuvent influencer négativement la précision des comptages ultérieurs.
   5. Placer un essai de migration membrane diapositive terminée sur la scène. En regardant l'image en temps réel affichée par le logiciel, réglez le grossissement avec le bouton de réglage du zoom de telle sorte que les bords d'une seule membrane ne sont que dans le champ de vision de la caméra.
      REMARQUE: Placer la lame sur une plaque de verre overtop le blanc scène de fond, il est plus facile à manoeuvrer la glissière pour l'imagerie.
   6. Ajustez les positions des sources lumineuses (7.6.1) et le temps d'exposition à reproduire aussi fidèlement que possible l'image idéale représentée sur la figure 2A. Selon la luminosité, temps d'exposition de 5-60 ms devrait être suffisant.
      REMARQUE:L'objectif est de produire une image avec aussi peu de couleur de fond que possible et une membrane éclairée uniformément sans réduire la fidélité d' image, à savoir, la surexposition conduisant à une perte de cellules visibles.
      1. Positionner les sources de lumière gauche et droite à un angle faible par rapport à la diapositive. Cela aidera à éliminer fond tache et les aberrations chromatiques. Essayez de garder chaque source de lumière directement en face de l'autre.
         REMARQUE: Pendant la manoeuvre de chaque source de lumière en position, tourner l'autre au large. Cela contribue à centrer la zone d'illumination sur la membrane elle-même plus facilement et avec précision.
   7. Retirer la lame et la balance des blancs de l'image à l'aide d'un seul clic dans le logiciel de microscope.
      NOTE: Le microscope est maintenant calibré. Enregistrer autant de paramètres que possible pour une utilisation future et de prendre note des positions de source de lumière et de l'intensité.

   8. Image Acquisition et Flatfield

   1. Dans le logiciel, réglezl'emplacement du dossier de capture, et la capture d'une image par membrane. Nommez les images suivant le modèle général de: Nom - ###, par exemple, contrôle - 001.tif, Contrôle - 002.tif, Test médicament - 001.tif, et ainsi de suite.
      NOTE: Pour obtenir les meilleurs résultats d'image, enregistrez le type de fichier d'image tiff sur les autres formats lossy tels que jpeg.
      REMARQUE: Les images ne suivent pas le modèle général sera toujours compté, mais ne seront pas soumis à groupement automatisé et Fielding plat.
      1. Si la correction Flatfield est souhaitée, pour chaque diapositive trouver une zone vide et prendre une image vierge après la convention de nommage: Nom - Blank.
         NOTE: Une ébauche est une zone sur la diapositive qui ne contient pas de membrane et représente l'éclairage de fond.
      2. Immédiatement avant l'imagerie, aplatir chaque membrane en appliquant une pression sur la lamelle et enlever autant de bulles piégées que possible.
   2. Dans ImageJ, aller à Plugins et ouvrir le plugin TC; par exemple, Plugins> Analyse> & #39; Transwell contre.
   3. Dans TC, cliquez sur le bouton 'Flatfield' et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le dossier dans lequel les images de la membrane ont été sauvées.
      NOTE: Seules les images enregistrées avec le modèle général ci-dessus sera automatiquement Flatfield corrigée et enregistrée dans un nouveau dossier appelé Flatfield dans le dossier choisi. Voir la figure 2B pour un exemple d'une image flatfield corrigée.

   9. Paramètres de configuration

   1. Ouvrez une image de membrane de test de migration dans ImageJ ( 'Fichier'> 'Ouvrir') et sélectionnez Image> Réglages> 'Seuil de couleur ... ». Observez la fenêtre Seuil de couleur pour ajuster les couleurs qui seront filtrés de l'image.
      1. Au bas de la fenêtre, définir la méthode de seuillage à 'Shanbhag', couleur Seuil pour «Blanc», et de l'espace couleur à «RGB» (bleu vert rouge); Fond sombre décochez si elle est sélectionnée.
      2. Réglez le hautcurseurs en cliquant et en faisant glisser les marqueurs à 0 et les curseurs inférieurs à 255 (laisser les curseurs inférieurs à 255). Assurez-vous que l'image est entièrement blanc.
   2. Ajuster les meilleurs curseurs verts et rouges jusqu'à ce que seuls les noyaux sont visibles.
      REMARQUE: Les paramètres sélectionnés varieront entièrement sur la tache cellulaire utilisée. Voir la figure 2C.
   3. Dans le plugin TC, saisissez les valeurs des principaux curseurs RGB en RGB de seuil »des champs de saisie des paramètres de configuration associés. Cliquez sur le "Ajouter / Modifier" bouton et remplacer la configuration.
      1. Laisser la taille Range Lower et Upper valeurs à 1 - Infinity.
   4. Dans le panneau Paramètres de configuration, cliquez sur "Enregistrer" pour écrire les paramètres sur le disque dur.

   10. Comptage Images et Calibration

   1. Ouvrez le plugin TC (8.2) et cliquez sur «Count Folder» et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le dossier à compter unnd attendre qu'elle se termine.
   2. Chaque échantillon compté est automatiquement ajouté à la table principale. Les colonnes clés sont «comte», «Qualité» et «Calibrer?».
      NOTE: Le comte de non-étalonné est le nombre de particules par membrane dans la zone affichée dans la colonne «Plage de la région».
      NOTE: La qualité varie d'environ -0,8 à 1,7; Q ≥ 0,5 est acceptable.
      1. Observer une coche dans la «Calibrer? colonne si une image est en position de calibration en fonction de sa ressemblance avec les paramètres idéaux.
         REMARQUE: la qualité et d'étalonnage peuvent suggérer que les paramètres actuels sont peut-être insuffisantes. Si, après une bonne 'Color Thresholding' et 'Taille Ranges' ont été sélectionnés et l'étalonnage est toujours suggéré, l'inspection de l'original et compté les images devraient être le déterminant final d'un compte valide.
   3. Sélectionnez Tous les échantillons du tableau Signalé pour le calibrage.
      1. Faites un clic droit dans til table et sélectionnez Recount> 'Taille suggérée. Cela recompter les images avec une zone de particules minimum suggéré.
      2. Faites un clic droit et sélectionnez 'Show Plot'. Observer la parcelle fréquence de dispersion des zones de particules. Une image idéale aura un graphique ressemblant à une longue distribution normale unilatérale à droite, à savoir, la courbe en cloche. Voir la figure 3B.
      3. Régler la gamme de taille inférieure, si nécessaire, en sélectionnant l'échantillon, clic droit, et en sélectionnant Recount> «Réglages manuels». Observez la boîte de dialogue d'installation manuelle. Entrez les paramètres souhaités et cliquez sur le comte de raconter l'image avec les nouveaux paramètres.
   4. Pour régler les comptes manuellement, sélectionner les échantillons, en cliquant droit sur la table, et sélectionnez «Ouvrir l'image avec des comptes». Observez l'image originale avec des marqueurs rouges représentant chaque particule comptée par le plugin.
      NOTE: Recount> 'Show compté image binaire »peut être utile de vérifier à quel point iertaines cellules sont résolus par le seuillage couleur.
      1. Pour ajouter un compte, maintenez 'Ctrl' et le clic gauche. Observer un marqueur à l'emplacement du curseur qui sera ajouté aux échantillons de comptage totale. Pour supprimer un marqueur, cliquez droit sur l'image. Le plugin va supprimer le marqueur le plus proche du curseur.
      2. Pour supprimer un groupe de marqueurs, utilisez un outil de sélection dans ImageJ pour sélectionner une région d'intérêt (ROI). Tout en maintenant "Ctrl", cliquez droit sur l'image et tous les marqueurs à l'intérieur du retour sur investissement seront supprimés. Observez le nombre de cellules dans la colonne «Count».

   11. Enregistrement / Résultats d'ouverture et exportation au format CSV

   1. Dans TC, aller à la barre de menu et cliquez sur "Fichier"> "Enregistrer les résultats". Observer la boîte de dialogue Résultats Enregistrer. Choisissez un nom et de destination et cliquez sur «Enregistrer».
      1. Utilisez 'Fichier'> 'Ouvrir les résultats »pour charger un fichier contenant toutes les données affichées dans le tableau principal, including la parcelle.
         REMARQUE: Le fichier de résultats enregistre les répertoires les images sont enregistrées dans Si les images d'origine sont déplacés après la sauvegarde, la «image originale ouverte" et "Ouvrir l'image avec des comptages de fonctions échoueront..
      2. Pour réinitialiser le répertoire de l'image, sélectionnez les échantillons, cliquez à droite de la table, et sélectionnez «Réinitialiser le répertoire d'image». Observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le nouveau dossier et si les images existent, les répertoires seront réinitialisés. Re-enregistrer le fichier de résultats.
   2. Pour enregistrer un fichier Comma Separated Values ​​(CSV), dans la barre de menu Aller à la "Fichier"> "Exporter au format .csv. Cela produit un fichier avec des échantillons organisés en groupes statistiques avec la moyenne compter et erreur standard de la moyenne; sa mise en page est conçu pour la représentation graphique rapide dans les programmes graphiques communs.
      NOTE: Les groupes statistiques sont basées sur les groupes créés au sein de TC.
      1. Si les échantillons suivent le modèle de nom général, sélectionner les échantillons à être grouped, clic droit et sélectionnez «regroupement automatique». Cela ajoute des échantillons avec le même "Nom" au même groupe. En utilisant l'exemple de contrôle - 1, Contrôle - 2, Traitement - 1, Traitement - 2: les deux contrôles seraient ajoutés au groupe «contrôle» et des traitements pour 'Traitement'.
      2. Ajouter des échantillons manuellement à des groupes en double-cliquant «Groupe» la cellule et en tapant de l'échantillon dans le nom du groupe. Sélectionnez les échantillons à être ajoutés à ce groupe, cliquez à droite et sélectionnez «Ajouter au groupe».

Representative Results

Calculatrice cellule de concentration

La figure 1 présente le processus global de la CCC étalonnage et l' acquisition d'images dénombrable. Figure 1A et 1B représentent l'image d'étalonnage P-carré et le calcul de P-carré en pixels. La CCC détermine la concentration des cellules dans un volume donné par la formule:

P-square A hémocytomètre a un volume de 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) et compte tenu de cette constante, le volume total de l'image peut être calculée après la conversion de pixels mm. Figure 1C est une image dénombrable idéale avec mise au point des cellules affichant l'éclairage de phase caractéristique et aucun graduations fond hémocytomètre. Enfin, le diagramme de dispersion des Figure 1D montre une forte corrélation, par rapport manuel automatisé comptage de cellules à partir de 57 images prises au cours de différentes expériences et types de cellules , y compris HTR8, ES-2, et Swan71. À noter, la gamme supérieure de la concentration était d' environ 5,6 x 10 ⁶ cellules / mL avec une extrémité inférieure de ~ 2,3 x 10 ³ cellules / mL (≈ 5 cellules par image). Il est suggéré que, si les chiffres sont en dessous de 10-15 cellules par image, l'échantillon doit être mis en suspension dans un volume plus petit pour augmenter la puissance statistique.

Acquisition et traitement des images pour les migrations Assay contre

Des centaines de membranes d'essai de migration ont été imagées au cours de nombreuses expériences, qui ont tous été ensemencé avec la lignée de cellules trophoblastiques humaines HTR8, Swan71 ou de l'ovaire lignée cellulaire de cancer ES-2. Parmi ces images, plusieurs ont été choisis pour représenter une gamme de catégories de très mauvais à l'excellente qualité basée sur la luminosité, la clarté et la couleur de Stainecellules d, et le degré de coloration de fond et des particules indésirables (bruit). L' utilisation de ces images, les paramètres par défaut de couleur RVB Seuil (≈ 150, 120, 0) sont déterminés (figure 2C) et utilisés comme base de référence dans tous les développements ultérieurs de l'algorithme. L'objectif était de maximiser la couleur nucléaire rapport de couleur totale, soit la majorité des pixels de couleur devrait être dans les noyaux cellulaires. Le panneau supérieur de la figure 2A représente la luminosité idéale de l' image, la cellule de clarté des noyaux et la couleur, et le bruit de fond négligeable. La luminosité de l'image est importante pour qu'il y ait un grand contraste assez entre la cellule et le fond pour produire une image binaire en noir et blanc.

Si cette différence est pas remplie, les zones de grandes ou imprévisibles peuvent être comptés par la ImageJ Analyser la fonction particules; le meilleur scénario est un fond complètement blanc. Dans l' opposition, le panneau inférieur de Figurer 2A a une extrême coloration et les cellules qui sont presque impossibles à distinguer de fond. Membranes avec ce degré de coloration sera très probablement produire des résultats fiables à partir du compteur de test de migration.

Dans certains cas, l'augmentation de la luminosité au niveau idéal peut affecter la fidélité d'image par surexposer l'image. De même, une forte exposition ou la luminosité peuvent produire des effets chromatiques systémiques avec une lumière progressive ou irrégulière et les zones sombres. Avec la correction de flatfield, ces effets peuvent être minimisés ou éliminés entièrement comme le montre la figure 2B (vs. supérieure du panneau inférieur). En outre, la correction flatfield est un bon moyen pour égaliser la luminosité de plusieurs images membranaires.

Calibration et validation de la migration Assay compteur

Pour aider les États-Uniser à mieux déterminer si les images de la membrane d'essai de migration répondent aux critères requis pour un comptage précis, deux qualificatifs ont été conçus, la qualité d'image appelé (Q), et l' étalonnage recommandation (CR). Fait important, les deux qualificatifs, comme son nom l'indique CR, sont des recommandations seulement et agissent comme guides plutôt que des juges absolus de la redevabilité de chaque image. Les deux Q et CR sont basées sur les paramètres de la parcelle la fréquence de diffusion de la zone de particules (10.3.2). Pour simplifier, une mesure peut être considérée comme les différentes formes de la courbe qui constituent la trame de fréquence. La mesure souhaitée d'un Q suffisant (≥0.5) a été déterminée par la distribution normale approximative observée de la taille des cellules. Généralement, les cellules qui sont insolubles les unes des autres, sur-teinté, ou tout simplement particulièrement grande, déplacent le skewedness à un droit de distribution à queue normale (figure 3B). En tant que tel, il est la métrique idéal d'une image typique calibrée. Avecl'ajout de bruit de fond, ce qui conduit normalement à un grand nombre de particules dans la gamme de 5/1 zone de pixels (figure 3A). Afin de calculer les paramètres de tracé, les données sont équipés de dix Savitzky-Golay courbes lissées de différents degrés de polynômes produites par la bibliothèque Java scientifique du Dr Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Essentiellement, cela crée de multiples points dans la région approximative de chaque extremum. Grâce à une série de grappes de densité cartes de minima et maxima locaux, un tableau général des paramètres de tracé peut être calculé comme une liste ordonnée, à savoir, au minimum, maximum, minimum / maximum de recouvrement, ..., n ^e extremum. En bref, la mesure dans laquelle les courbes lissées adapter les données de fréquence détermine serrés les extrema points sont. Plus le regroupement des non-chevauchement des extrema, plus Q devient. En théorie, Q représente la clarté de l' image globale basée sur til distribution des tailles de particules différentes.

Que l' opérateur booléen CR est vrai ou non dépend de la séquence d'extrema. A partir de la figure 3A, la liste ordonnée serait minimale, maximale et une séquence de chevauchement extrema en fonction des propriétés de la courbe de Savitzky-Golay. Depuis la figure 3A représente une image non calibrée, cette séquence générale des extrema drapeaux CR en tant que véritables, ce qui suggère à l'utilisateur que l'image peut avoir besoin d' étalonnage. Le déplacement vers l' avant, on voit que sur la figure 3B, cette liste serait identique mais à l'exclusion du premier minimum. Ainsi, les mesures d'images non calibrées et calibrées idéales ont été déterminées. Les écarts par rapport à ces mesures seront généralement signaler une image à l' étalonnage et réduire Q ≤ 0, comme le cas avec la membrane de bruit de fond dans la figure 3C. L'application de ces qualificatifs à une sélectionde modestes pour d' excellentes images, en ce qui concerne la luminosité et le bruit de fond, il est clair que les chiffres de l' image calibrée sont beaucoup plus près comptages manuels que étalonné (1,9% ± 0,3 vs 21,7% ± 2,9, respectivement; la figure 3D, E). Compte tenu de la qualité globale des images choisies pour l'analyse (étalonné = 0,71 ± 0,04; moyenne ± SE), il y a eu une légère augmentation prévue seulement dans Q après le calibrage ( = 0,90 ± 0,04). Pris ensemble, Q suggère le potentiel de redevabilité globale d'une image alors que CR est un indicateur fort de savoir si la calibration est réussie ou non.

Timing La comparaison des deux contre Cell Concentration et migration Assay Compteur

figure 4A compare CCC temps d'étalonnage entre l' utilisateur 1 et 2. Comme prévu, l' utilisateur 1 est nettement plus rapide que l' utilisateur 2, en même temps, en prenant en moyenne environ cinq minutes pour le calibrage de la CCC. Afin de comparer comptage manuel de hémocytomètre et les taux automatisés, le taux d' emploi de comptage en utilisant un compteur de pointage a été comparé au temps qu'il a fallu pour prendre neuf images de la chambre de hémocytomètre et compté dans CCC (figure 4B). Une concentration typique de cellules de 1,15 x 10 ⁶ cellules / ml a été utilisé pour comparer les cadencements, conduisant à une augmentation moyenne de 1x en débit. Ce taux varie en fonction du nombre de cellules chargées dans lehémocytomètre que le temps total pris pour capturer des images et de les traiter est indépendant du nombre de cellules.

Enfin, les horaires englobant l' acquisition d'images de membranes, la quantification au sein de TC, et le réglage manuel de ces images a été mesurée à la figure 4C. Notamment, 12 membranes d'essai de migration à faible nombre de cellules (Total = cellules 10,571) et fond substantiel coloration et les débris cellulaires ont été choisis pour faciliter le pire des cas qui nécessiterait des ajustements manuels à nombre de cellules. Cela se reflète dans l' ajustement figure 4C colonne (Adj) où il a fallu en moyenne 13 minutes pour éliminer les comptages non désirées et ajouter des cellules manquées. A titre de comparaison pour le comptage manuel, optimal taux de comptage de cellules ont été déterminées avec compteur de cellules; images haute de la membrane de qualité à haute densité cellulaire ont été utilisés (résultats non montrés). Cela a donné un taux maximal moyen entre l' utilisateur 1 et 2 de 9,1 x 10 ³ cellules / h(~ 2,5 cellules / s). L' utilisation de ces numéros, les membranes de la figure 4C ont été comptées 4,4x plus rapide avec TC qu'il serait attendu à un taux d' emploi maximal. Les gains de temps sont directement en fonction du nombre de cellules et de la qualité de l'image, en comptant les membranes de migration nécessitant peu ou pas d'ajustement et de haute densité cellulaire (~ 7000 cellules / membrane), TC généré le nombre de cellules 1,395x plus rapidement que le taux d'emploi maximal.

Figure 1: Calculatrice de concentration cellulaire. (A) contraste de phase micrographie de la place principale centrale de la hémocytomètre prise à 40X grossissement total. La barre d'échelle représente 200 um. (B) A recadrée version de l'image à partir de (A) représentant ce que la longueur de mesurer sur le hémocytomètre. La longueur colonne de fenêtre Résultats a été mis en évidence pour faciliter l'identification. barre jaune= 1 mm. (C) Un micrographie idéal d'un hémocytomètre contenant des cellules HTR8 après étalonnage du microscope et le logiciel à 40X grossissement total avec une résolution de 1600 x 1200 px. Barre d'échelle = 200 um. (D) Un diagramme de dispersion comparant comptages manuels en utilisant le compteur ImageJ plugin cellule par rapport à des comptages automatiques des mêmes images en utilisant calculatrice cellule de concentration. n = 57 images. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: test de migration contre les images représentatives. (A) Le panneau supérieur est une huitième partie d'une membrane totale représentant une image idéale avec un fond minimal; Barre d'échelle = 200 um. lepanneau inférieur contient une image importante coloration de fond qui affecte gravement la précision du comptage automatique; Barre d'échelle = 585 um. (B) Le panneau supérieur représente une image sombre de bonne qualité qui a produit les chiffres inexacts. Le panneau inférieur est une version dénombrable de la même image après correction de flatfield. Les barres d'échelle = 593 um. (C) Le panneau supérieur représente un zoom avant en vue d'une membrane typique. Le panneau inférieur est la même image suivie de la ImageJ couleur désirée seuillage (RGB Seuil = 150, 120, 0) pour supprimer fond intercellulaire et la majorité du cytoplasme visiblement teinté. Toutes les images ont été prises à 1.35X grossissement total avec une portée de dissection calibrée à une résolution de 2.592 x 1.944 px de multiples invasions de test de migration de HTR8 colorées à l'hématoxyline. Les barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour rivaliserwa version plus grande de cette figure.

Figure 3: Calibration et validation de test de migration c ounter. (A) Un exemple typique d'une image non étalonnée de haute qualité. (B) La version calibrée de (A) en utilisant le Recount de migration test compteur> 'Taille suggérée. (C) Un tracé de fréquence typique d'une membrane de faible qualité d'image avec significative tache de fond ou dans l' obscurité totale. (D) Un diagramme de dispersion comparant comptage manuel à l' aide du plug - in ImageJ compteur de cellules et de migration test contre comptages automatisés. (E) Un graphique à barres montrant la différence moyenne pour cent des étalonné par rapport comptages automatisés non étalonnées. Les données sont la moyenne ± SE. P <0,0001, n = 30, test t non apparié avec corre Welchction. Les mêmes images ont été utilisées pour D et E. Calibration des deux a été fait avec le Recount> 'Taille suggérée »et Recount>' Réglages manuels" pour affiner la taille minimale compté et le seuil de couleur. Aucun réglage manuel de comptage ont été effectués en utilisant «l'image ouverte avec les chiffres de la fonction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Timing of Cell Concentration contre et essai de migration contre l' utilisation. (A) Comparaison des temps d'étalonnage de CCC (étapes 1 et 2) entre l' utilisateur 1 (CCC / expert TC) et l' utilisateur 2 (CCC / TC novice). (B) Manuel des temps de comptage de cellules ont été en moyenne sur cinq essais et exprimés en cellules comptées par minute. automatic chiffres ont été calculés par des durées moyennes pour capturer neuf images d'une chambre d'hémocytomètre et comptées avec la CCC. La concentration cellulaire utilisée était d' environ 1,15 x 10 ⁶ cellules / ml. Les données sont la moyenne ± SE. n = 5. (C) timings Transwell Compteur ont été comparés sur trois catégories: acquisition (Acq; les étapes 7 et 8), la quantification (Qnt; étapes 10.1-10.3.3 en utilisant les paramètres de configuration par défaut), et le réglage manuel (Adj; steps 10.4 -1.4.2). Les membranes quantifiées ont un haut degré de coloration de fond et les débris afin de nécessiter un ajustement manuel substantiel pour des comptages précis. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les étapes critiques, le dépannage et Limitations

La nature même des méthodes de calcul automatiques, en particulier celles de l'analyse des particules, nécessite la capacité mathématique pour définir ces particules. Par conséquent, la précision de la fois Calculatrice cellule de concentration et de détermination de la migration compteur est majorly dépend fidélité d'image, qui est, à quel point l'image capturée ressemble à la membrane échantillon de cellules ou de test de migration. Il est donc de la plus haute importance à suivre microscope et les protocoles d'étalonnage logiciels associés aussi bien que possible. Cela inclut limiter le bruit de fond, ce qui réduit les particules indésirables, la capture lumineuse et uniformément images en mise au point et enregistrer dans des formats de fichiers non-lossy tels que tiff. Ainsi, les deux plugins sont susceptibles de produire des résultats erronés si ces exigences ne sont pas remplies. Il est donc toujours une bonne pratique de doubles comptages contrôle de cellules afin de déterminer si elles correspondent aux attentes visuelles quand en doubt. En effet, si les résultats ne correspondent pas, en comparant l'image originale avec l'image binaire peut aider à élucider la question (10.4 note). Dans certains cas, les plus sombres images de test de migration peuvent contenir de grandes zones qui ont été comptés en raison de valeurs de pixels qui tombent dans les limites de seuil de couleur. En général, en utilisant une image flatfield va supprimer l'obscurité et la couperose et de prévenir les chiffres les plus indésirables dues à des irrégularités chromatiques.

Compte tenu de ces questions possibles et relativement communs, il est important de suivre les directives standards d'intégrité de l' image comme celles proposées par le Nature Publishing Group et d' autres ^13. Pour garder les chiffres cohérents, tout ajustement d'une image doit être appliquée également à tous les autres. Cela inclut, mais sans s'y limiter le contraste, la saturation, la luminosité, le gain, les filtres, tels que la moyenne et la netteté, et les filtres de couleur. Réglage de gamma doit être évitée car elle applique un changement non-linéaire de la couleur de pixel et ainsi peut affecter chaque image différentely ^14. Lors de l'application d'un temps d'exposition commune aux images avec quelques cellules (<1000), cela peut conduire à une surexposition et une perte de fidélité de l'image. A l'inverse, une membrane avec des milliers de cellules peut nécessiter des temps d'exposition plus élevés afin d'éviter une sous-exposition. Par conséquent, il est préférable d'ajuster les images aussi peu que possible, et seulement si nécessaire, pour maintenir la plus haute fidélité d'image possible.

Même avec une image de haute fidélité, les vrais comptages de particules peuvent être gravement faussée par des particules indésirables. Lors de l'utilisation calculatrice cellule de concentration, si un échantillon contient des quantités importantes de débris cellulaires, en particulier des zones similaires à celles des cellules en suspension, ce qui peut fausser le résultat. Dans certains cas, cela peut empêcher une analyse automatisée si les débris ne peuvent pas être minimisé. De même, les membranes d'essai de migration qui contiennent des niveaux élevés de bruit de fond de couleur semblable à cellules colorées ou des cellules laissées en place depuis le côté arrière de la membrane, probablement produire iRésultats nPrécision. Ces particules indésirables peuvent normalement être enlevés en quelques manières: augmenter la luminosité de la source ou le temps d'exposition de lumière, la modification du seuil de couleur pour être plus rigoureux, ou supprimés manuellement via 'Ouvrir l'image avec des comptes »(10.4). Il est important de noter que ce protocole produit la qualité optimale de l'image requise pour CCC et TC pour maintenir la précision. Cependant, TC est capable de compter les images de manière significative moins de qualité, différents grossissements, ou différentes taches de couleur, en général ne nécessitant plus de temps passé sur des réglages manuels (10.4).

Lors de l'étalonnage d'une image sur membrane d'essai de migration, il est important de tenir compte de la résolution de l'image et de la taille relative des cellules. Comme décrit précédemment, la qualité de l' image (Q) et la recommandation d' étalonnage (CR) dépendent des paramètres de tracé de fréquence de surface des particules. Des images analysées, chaque cellule prend en moyenne de 1 / 100.000 de lasurface totale de l'image. Lors de l'utilisation d'images de quelques millions de pixels avec un petit rapport de la taille des cellules, la variation de la taille des cellules est également faible. Autrement dit, la variance ne peut aller 10-60 px. Mais, comme la zone de cellule de rapport de surface d'image devient plus grande, la distribution des cellules dont la taille augmente, réduisant ainsi le kurtosis de la distribution normale des tailles de cellules en diminuant la fréquence d'une zone donnée. Cela peut faire le calcul automatisé de la zone cellulaire plus difficile, voire impossible, car une superficie minimale déterminée ne peut être déterminée. De même, cela vaut également pour des images avec peu le nombre de cellules dans laquelle la fréquence de tailles différentes de cellules peut être très faible (<50). Par conséquent, lors de l'analyse des images avec différentes résolutions que celles utilisées dans cette étude ou différentes distributions de taille des cellules, l'identification manuelle de la plage de taille des cellules peut être nécessaire (10.3.3).

Importance et orientations futures

Le plug-in ImageJ compteur de cellules a été initialement Releelon en 2001 par le Dr Kurt De Vos et a servi de base pour le manuel cellule de comptage à ce jour. Pour continuer la tendance des outils disponibles gratuitement pour la communauté biologique, calculatrice cellule de concentration et de test de migration compteur offrent la prochaine étape outils gratuits pour aider à augmenter le débit et la reproductibilité inter-expérimentale des essais de migration. Le résultat des tests de migration d'extrémité est fortement dépendante du nombre de cellules mises en culture. Ergo une numération cellulaire fiable est une nécessité pour la reproductibilité. De cette façon, la CCC offre à la fois une précision accrue en raison de certitude statistique plus élevé de concentration cellulaire et la réduction des temps de comptage en préservant la santé des cellules.

En outre, le résultat des deux plugins de fin est un compte du nombre de cellules et non pas un indice relatif comme la fluorescence. Diverses autres protocoles existent qui mesure la fluorescence après coloration , mais ces méthodes souffrent d' un manque de sensibilité ^13. Adobe Photoshop propose sa propre analyse de particules tool mais le programme doit être acheté à l' emploi et ne propose pas l'analyse post-comptage disponible à partir de la migration test compteur ^20. Les deux modules reposent sur la fonction de comptage de particules à partir ImageJ et par conséquent peuvent être modifiés par l'utilisateur final en modifiant les macros utilisées par ImageJ. Cela offre une plus grande flexibilité pour l'utilisateur d'étendre la portée des plugins à d'autres particules en créant de nouvelles macros. La poursuite du développement pour augmenter la largeur des particules dénombrables et intégrer les contributions de l'utilisateur final est la prochaine étape logique. En combinant les principes de base de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision. Les plugins sont disponibles gratuitement en téléchargement avec des instructions d'installation à partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required