Biology

स्वचालित मात्रा का ठहराव और सेल गिनती प्रक्रिया ImageJ plugins का उपयोग का विश्लेषण

Published: November 17, 2016 doi: 10.3791/54719

Jacob O'Brien¹, Heyam Hayder¹, Chun Peng¹

¹Department of Biology, York University

Abstract

स्वास्थ्य के ImageJ के राष्ट्रीय संस्थान एक शक्तिशाली, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर सुइट है। ImageJ व्यापक कण विश्लेषण एल्गोरिदम जो प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता विभिन्न जैविक कणों गिनती करने के लिए है। जब सेल के नमूने की बड़ी संख्या की गिनती, hemocytometer समय के लिए संबंध के साथ एक टोंटी प्रस्तुत करता है। इसी तरह, ImageJ प्लगइन सेल काउंटर के साथ पलायन / आक्रमण assays से झिल्ली की गिनती है, हालांकि सही, असाधारण श्रम, गहन व्यक्तिपरक, और कलाई में दर्द पैदा करने के लिए कुख्यात है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम स्वचालित hemocytometer (या ज्ञात मात्रा) और पलायन / आक्रमण सेल गिनती का एकमात्र कार्य के लिए ImageJ भीतर दो plugins विकसित की है। दोनों plugins कम से कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च गुणवत्ता micrographs हासिल करने की क्षमता पर निर्भर हैं। वे का उपयोग करने के लिए आसान और त्वरित गिनती और निर्मित में विश्लेषण उपकरणों के साथ बड़ा नमूना आकार के विश्लेषण में गिना जाता है की जांच में मदद करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। मूल सिद्धांत के संयोजन सेएक स्वचालित मतगणना एल्गोरिथ्म और बाद मतगणना विश्लेषण के साथ सेल काउंटर की है, यह बहुत आसानी के साथ जो पलायन assays सटीकता के किसी भी हानि के बिना संसाधित किया जा सकता बढ़ जाती है।

Introduction

इन विट्रो सेल की गिनती में टिशू कल्चर प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक महत्वपूर्ण बुनियादी तकनीक है। सही रूप में एक संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण प्रयोगात्मक reproducibility और मानकीकरण ^{1,2 के} लिए आवश्यक है। सेल गिनती एक hemocytometer का उपयोग के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित तरीकों की एक किस्म है, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान ^3,4,5 के साथ प्रत्येक का उपयोग कर मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है। सेल गिनती के लिए स्वचालित तरीकों में से अधिकांश दो वर्गों, उन है कि कल्टर सिद्धांत का उपयोग करें या प्रवाह cytometry में से एक हैं। कल्टर काउंटर सेल संख्या और आकार निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं विद्युत प्रतिरोध का लाभ ले। वे तेजी से, सही और प्रवाह cytometers की तुलना में सस्ता है। हालांकि, वे शायद ही कभी केवल सेल गिनती के लिए उनकी काफी लागत के कारण मैनुअल गिनती ³ की तुलना में उपयोग किया जाता है। cytometers प्रवाह, दूसरे हाथ पर, महंगे हैं, लेकिन वे इस तरह के सेल गिनती, कोशिकाओं के आकार, सेंट के विश्लेषण के रूप में कई आवेदन किया हैructure और आंतरिक सेल मापने ^4,5 मार्करों। मशीनें कि इन दोनों सिद्धांतों का भी उपयोग कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं। मैनुअल गिनती सस्ती लेकिन समय लेने वाली और पूर्वाग्रह के अधीन है, जबकि स्वचालित तरीके समय मैनुअल गिनती के लिए आवश्यक का एक अंश के साथ आते हैं, लेकिन महंगी मशीनों ⁶ का उपयोग कर।

अन्य आम सेल संस्कृति प्रक्रियाओं इन विट्रो सेल गतिशीलता assays, अर्थात्, सेल प्रवास और आक्रमण ⁷ में हैं। प्रवास और आक्रमण assays सामान्यतः एक कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया के जवाब में सेल गतिशीलता और invasiveness जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, वे व्यापक रूप से भ्रूण विकास, भेदभाव, भड़काऊ प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस अनेक प्रकार की कोशिकाओं ^7-11 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। कोशिकाओं है कि पलायन या एक प्रवास परख के झरझरा झिल्ली के माध्यम से आक्रमण किया है दो अलग अलग तरीकों में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। सबसे पहले, एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं को धुंधला हो जाना, हदबंदी से इधर-उधरझिल्ली, और मात्रा का ठहराव एक फ्लोरोसेंट पाठक ¹² का उपयोग कर रहा हूँ। मात्रा का ठहराव की इस पद्धति की एक सीमा है कि कोई रिकॉर्ड झिल्ली के बनाए रखा जा सकता है और वहाँ आगे के विश्लेषण के लिए ¹³ कोई संभावना नहीं है। दूसरी मात्रा का ठहराव विधि चले गए पर / हमला किया जाता है तय की और फ्लोरोसेंट रंजक या अधिक सामान्यतः, ऐसे क्रिस्टल बैंगनी, toluidine नीले रंग की डाई या hematoxylin के रूप में कोशिकाविज्ञान रंगों के साथ साथ दाग किया जा कोशिकाओं; फिर कोशिकाओं स्वयं इन झिल्ली जो एक बहुत समय लेने वाला काम है ^12,13 की औंधा सूक्ष्म छवियों का उपयोग मात्रा रहे हैं।

मैनुअल सेल गिनती की खामियों को दूर करने के लिए, दो विश्वसनीय और सटीक सेल एकाग्रता के लिए और प्रवास परख के लिए स्वचालित सेल काउंटर विकसित किए गए। ये स्वचालित सेल काउंटर एल्गोरिदम एक प्लगइन ओरेकल के जावा कंप्यूटर भाषा का प्रयोग के रूप में ImageJ के लिए विकसित किए गए। ImageJ एक सार्वजनिक और व्यापक रूप से इस्तेमाल छवि प्रसंस्करण Hea के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा विकसित उपकरण हैLTH (एनआईएच) ^14,15; इस प्रकार, ImageJ के लिए इन plugins लेखन जैविक समुदाय में आसानी से एकीकरण की सुविधा।

सेल गिनती के स्वचालन मैनुअल गिनती की तुलना में उच्च throughput और reproducibility सुनिश्चित करता है। हालांकि अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर और plugins छवि विश्लेषण ^5,16,17, सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर प्लगइन के माध्यम से सेल एकाग्रता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से और भी कोशिकाओं और उपचार के dilutions संभाल सकते हैं। इसके अलावा, इन दो काउंटरों से सभी परिणाम और गणना बचाया और निर्यात किया जा सकता है। इस पत्र में वर्णित दो plugins एक विदारक गुंजाइश के उपयोग के माध्यम से लाइव सेल इमेजिंग और देखने के बड़े क्षेत्र (पूरे झिल्ली पर कब्जा) प्रवास परख झिल्ली के लिए इमेजिंग के लिए एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: plugins से स्थापना के निर्देश के साथ डाउनलोड के लिए आसानी से उपलब्ध हैं।

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Protocol

1. यौगिक सूक्ष्मदर्शी और कैमरा सेटअप (सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर)

प्रकाश समायोजन घुंडी के साथ पूर्ण करने के लिए बल्ब चमक बढ़ाने 4X उद्देश्य लेंस के लिए स्विच, और यह सुनिश्चित चरण विपरीत फिल्टर चुने गए हैं।
नोट: एक काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ टिशू कल्चर के लिए कोई औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप, जैसे, पीएचपी चरण विपरीत, मानक माइक्रोस्कोप और कैमरा प्रक्रियाओं का पालन किया जा सकता है।
माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर के भीतर, मूल्यों डिफ़ॉल्ट करने के लिए छवि पर कब्जा सेटिंग्स सेट।
नोट: इन सेटिंग्स के स्थान खोजने के लिए माइक्रोस्कोप के यूजर मैनुअल को देखें।
1. 'चमक', 'इसके विपरीत', और 100% करने के लिए 'संतृप्ति' और 'गामा' और 1.0 करने के लिए 'लाभ' की स्थापना की।
  नोट: सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, 'चमक' और 'विपरीत' के बजाय 100% 0% के एक मूल्य के लिए डिफ़ॉल्ट सकता है।
2. सेट छवियों काले और सफेद उच्चतम संकल्प उपलब्ध नही का उपयोग करने में कब्जा कर लिया हैई (1600 x 1,200 पिक्सल (पिक्सल) या अधिक)।
  नोट: एक 0% की 'संतृप्ति' के लिए पर्याप्त है, तो एक काले और सफेद सेटिंग अनुपलब्ध है।
खुर्दबीन मंच पर एक मानक hemocytometer रखें और के रूप में (चित्रा 1 ए) में दिखाया गया एक छवि पर कब्जा; इस 'खंड कैलिब्रेशन छवि' है। आवश्यकता के रूप में जोखिम समय समायोजित करें।

2. छवि मात्रा कैलिब्रेशन

ओपन ImageJ और प्लगइन्स मेनू से, सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर (सीसीसी) प्लगइन, जैसे, प्लगइन्स> विश्लेषक> 'सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर' शुरू करते हैं।
1. सही साइड 'छवि मात्रा कैलिब्रेशन' पैनल दिखाई नहीं है, यह दिखाने के लिए 'जांचना' पर क्लिक करें।
ImageJ में, 1.3 चरण ( 'फ़ाइल'> 'ओपन') से और सीसीसी क्लिक में 'जाओ छवि आयाम' बटन पर 'खंड कैलिब्रेशन छवि' खुला।
नोट: यह दोनों छवि में भर जाएगा और चौड़ाईस्वचालित रूप से पिक्सल में छवि संकल्प के साथ ऊंचाई पाठ बक्से।
ImageJ में, 'सीधी रेखा उपकरण के चयन के उपकरण के बगल का चयन करें और क्लिक करके और कर्सर को खींच कर hemocytometer प्राथमिक (पी) की पूरी लंबाई भर में एक सीधी रेखा खींचना (चित्रा 1 बी) में प्रदर्शन -square।
1. सीधी रेखा माप युक्त परिणाम विंडो प्रदर्शित करने के लिए 'एम' कुंजी पुश। सीसीसी में 'पी-वर्ग लंबाई' पाठ बॉक्स (चित्रा 1 बी) में लंबाई स्तंभ से मान लिखें।
2. 'छवि मात्रा की गणना' बटन पर उत्पादन करने के लिए छवि मात्रा पाठ बॉक्स में छवि मात्रा क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से, अगर छवि की मात्रा पहले से ही जाना जाता है, छवि मात्रा पाठ बॉक्स में नाथन में मात्रा टाइप करें।
'सहेजें' बटन पर क्लिक करें।
ध्यान दें: प्लगइन अब calibrated है।

3. कैमरा एक्सपोजर कैलिब्रेशन

निम्नलिखित सेल कटाईhemocytometer के एक कक्ष में hemocytometer, लोड कोशिकाओं के 10 μL के माध्यम से गिनती और खुर्दबीन मंच पर जगह है।
1.2 कदम से एक ही सेटिंग्स का उपयोग करना, जोखिम समय समायोजित इतना है कि hemocytometer की पृष्ठभूमि लाइनों गायब हो जाते हैं।
1. ध्यान समायोजित इतना है कि कोशिकाओं के आंतरिक कोशिका झिल्ली से अधिक गहरा है, और सेल के केंद्रीय पार अनुभाग नहीं डंडे के अंदर फोकस का संकेत है।
2. इसके अलावा जोखिम को समायोजित इतना है कि कोशिकाओं overexposed नहीं कर रहे हैं और (चित्रा 1 सी) में दिखाया गया है उन जैसे लगते हैं।
  नोट: थोड़ा दिखाई hemocytometer लाइनों स्वीकार्य हैं। इसे बचाने के लिए या रिकॉर्ड करने के लिए इन सेटिंग्स सटीकता और reproducibility बनाए रखने के लिए सिफारिश की है।

4. छवि अधिग्रहण

प्रत्येक कोशिका नमूना के लिए, लोड 10 hemocytometer के दोनों कक्षों में μL सांख्यिकीय अनुमान पावर ² बढ़ाने के लिए। खुर्दबीन मंच पर जगह hemocytometerइमेजिंग के लिए।
ध्यान दें: संकल्प और प्रत्येक छवि की बढ़ाई 'खंड कैलिब्रेशन छवि' के रूप में ही किया जाना चाहिए। प्लगइन किसी भी चयनित फ़ोल्डर के सभी छवियों में गिना जाता है; रख छवियों को एक ही फ़ोल्डर में एक साथ गिना जा।
1. एक फ़ाइल नाम ऑटो वेतन वृद्धि समारोह उपलब्ध है, तो यह मोड़ पर है और यकीन है कि प्रत्येक छवि throughput बढ़ाने के लिए कब्जा करने के बाद नहीं दिखाया जाता है।
  नोट: मैन्युअल बचत और प्रत्येक छवि को बंद करने के लिए तेजी से नीचे की प्रक्रिया धीमी हो जाएगी। एक ऑटो वेतन वृद्धि समारोह की उपलब्धता के बारे में जानकारी के लिए माइक्रोस्कोप के यूजर मैनुअल को देखें।
2. hemocytometer के मध्य क्षेत्र के कम से कम तीन गैर अतिव्यापी छवियों पर कब्जा हालांकि अधिक (5-10) शुद्धता बढ़ाने के लिए सिफारिश की है।
  नोट: दोनों के ऊपर और कक्षों के नीचे क्षेत्रों से बचें के रूप में कोशिकाओं दोनों स्थानों पर घनत्व में वृद्धि करते हैं। हर कक्ष के लिए छवियों का एक ही नंबर ले लो। इस मतगणना के दौरान प्लगइन के समुचित कार्य के लिए आवश्यक है।
5. छवि गिनती और dilutions
1. सीसीसी में, 'गणना प्रकोष्ठों' पर क्लिक करें और निर्देशिका चुनें संवाद बॉक्स निरीक्षण करते हैं। गिना जा के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें।
2. एक फ़ोल्डर का चयन करने के बाद नमूना संख्या इनपुट बॉक्स का निरीक्षण करें। चैम्बर प्रति लिया छवियों, यानी, 4.1.2 की संख्या दर्ज करें, और क्लिक करें 'ठीक है। प्लगइन अब सभी जेपीजी, झगड़ा, और PNG वर्णमाला के क्रम में चयनित फ़ोल्डर में छवियों की गिनती होगी।
  नोट: 'नमूना व्यूअर का' बटन पर क्लिक नमूना दर्शक गिना नमूने के बारे में जानकारी प्रदर्शित खिड़की लाएगा। नमूना एकाग्रता चैम्बर प्रति गए सभी छवियों की औसत एकाग्रता है। unitless सांद्रता के साथ नमूने ऐसी दवा या छोटे अणु उपचार के अतिरिक्त के रूप में इस सूची में जोड़ा जा सकता है।
  1. सेल के नमूने ब्योरा यदि सांद्रता एक ही नमूने (धारा 4) की गिनती के भीतर काफी भिन्नता है।
    नोट: सभी के लिए dilutions की गणना करने के लिए टीवह गिना-नमूने, सीसीसी स्वचालित रूप से फार्मूला सी ₁ वी सी ₁ = ₂ वी ₂ का उपयोग करता है।
3. एक 96 अच्छी तरह से थाली + 1 अतिरिक्त के 30 कुओं में 200 μL प्रति 15,000 कोशिकाओं बोने के परिदृश्य का उपयोग करें:
  1. 15,000 C2 लेबल के सही और 200 के लिए एकाग्रता मात्रा पाठ बॉक्स के लिए पाठ बॉक्स सेट, 'μL' से सटे कॉम्बो बॉक्स इकाई बदल रहा है।
    नोट: प्लगइन अंततः कोशिकाओं / एमएल में एकाग्रता की गणना करेगा।
  2. सुनिश्चित करें कि मात्रा कॉम्बो बॉक्स V2 चयनित किया गया है (अंतिम मात्रा) बनाने के लिए और सही करने के लिए पाठ बॉक्स में मात्रा इकाई कॉम्बो बॉक्स में 'μL' का चयन दर्ज 6200 (200 μL एक्स (30 + 1))।
4. नीचे बाएँ सूची बॉक्स के लिए वर्तमान में प्रवेश किया कमजोर पड़ने जोड़ने के लिए 'गणना कमजोर पड़ने' पर क्लिक करें।
  नोट: प्रत्येक कमजोर पड़ने जोड़ा के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए हल हो जाएगा और सही करने के लिए पेड़ चित्र में दिखाया गया है। प्रत्येक प्रविष्टि पर डबल क्लिक करें विस्तार करने के लिए।
5. पर क्लिक टीवह 'नमूना व्यूअर का' बटन नीचे 'सहेजें' बटन पर सभी नमूना डेटा और dilutions दायर करने के लिए लिखने के लिए।
6. नोट: ये आंकड़े 'लोड' पर क्लिक करें और सहेजी गई फ़ाइल का चयन करके किसी भी समय बरामद किया जा सकता है।
6. प्रवास और आक्रमण (काउंटर)
1. मानक Boyden कक्ष विधि का उपयोग कर ^7-9 प्रवास और आक्रमण assays के प्रदर्शन।
2. बाद कोशिकाओं चले गए हैं / पर आक्रमण किया, ध्यान से डालने के भीतर मीडिया inverting और धीरे दोहन से हटा दें। बाती दूर किसी भी अतिरिक्त मीडिया एक कागज तौलिया को किनारे को छूकर झिल्ली के नीचे का पालन किया।
  नोट: तौलिया करने के लिए झिल्ली ही मत छुओ, इस पालन कोशिकाओं को बेदखल कर सकता है।
3. फिक्स और एक अलग समाधान के 500 μl एक 24 अच्छी तरह से थाली युक्त प्रत्येक पंक्ति के साथ स्थापित की रिपोर्ट में ^7-9 के रूप में कोशिकाओं दाग ~, जैसे, लगानेवाला, दाग 1, दाग 2, और दोहरा आसुत जल (DDH ₂ हे)। 1x पीबीएस टी के साथ एक दूसरे की थाली तक भरेंओ काटने से पहले में सम्मिलित जगह है।
4. उन्हें DDH ₂ हे के साथ भरा कुओं में रखकर सम्मिलित धो और उलटा द्वारा कोशिकाओं को दूर swabbing से पहले पानी के निकास DDH ₂ ओ के साथ सम्मिलित भरें।
5. ख्याल रख रही झिल्ली झिल्ली को नुकसान नहीं के ऊपर से संयुक्त राष्ट्र के चले / संयुक्त राष्ट्र के आक्रमण कोशिकाओं को हटाने के लिए एक साफ सूती applicator का प्रयोग करें। झिल्ली के किनारों के आसपास पूरी तरह से।
6. एक उस्तरा या एक छुरी का उपयोग कर झिल्ली कट और ध्यान से एक साफ गिलास स्लाइड पर झिल्ली (नीचे-ऊपर की ओर) हस्तांतरण।
7. बढ़ते समाधान की एक छोटी सी बूंद के नीचे और झिल्ली के शीर्ष पर जोड़ें और एक पतली कवर पर्ची के साथ कवर किया।
  नोट: बढ़ते समाधान के भीतर बुलबुले को फँसाने मायने रखता है की सटीकता को संरक्षित करने से बचें।
7. स्कोप और कैमरा सेटअप विदारक
1. माइक्रोस्कोप के प्रकाश स्रोत और कैमरा चालू करें।
  नोट: माइक्रोस्कोप की विस्तृत निर्देशों के लिए उपयोगकर्ता के मैनुअल को देखें।
2. बुद्धिमाइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर, सेट छवि पर कब्जा सेटिंग्स हीन मूल्यों डिफ़ॉल्ट करने के लिए।
  नोट: एक औसत समारोह में मौजूद है, चार के एक मूल्य की सिफारिश की है। यह औसत और छवि अधिग्रहण के समय की डिग्री के बीच एक अच्छा समझौता है। इसी तरह, sharpening की एक छोटी सी डिग्री छवि निष्ठा वृद्धि हो सकती है।
  1. 'चमक', 'इसके विपरीत', और 100% करने के लिए 'संतृप्ति' और 'गामा' और 1.0 करने के लिए 'लाभ' की स्थापना की।
    नोट: सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, 'चमक' और 'विपरीत' के बजाय 100% 0% के एक मूल्य के लिए डिफ़ॉल्ट सकता है।
  2. प्रदर्शन सेट (वास्तविक समय) और कब्जा संकल्प उनके अधिकतम सेटिंग्स करने के लिए (1600 x 1,200 पिक्सल और 2,592 x 1,944 px, क्रमशः)।
    नोट: प्रदर्शन संकल्प यदि ताज़ा दर भी धीमी है के रूप में आवश्यक समायोजित किया जा सकता है। कम प्रस्तावों इसे और अधिक कठिन सही ध्यान केंद्रित करना लेकिन ताज़ा दर में वृद्धि होगी।
3. विदारक गुंजाइश के चरण के लिए, एक ठोस सफेद backgro का उपयोगund; एक काले रंग की पृष्ठभूमि या कांच के लिए अपर्याप्त है।
4. ऊपर चरण प्रकाश स्रोत अधिमानतः दो लचीला एलईडी रोशनी से सही करने के लिए प्रयोग करें, और मंच के छोड़ दिया है।
  नोट: एक नीचे चरण प्रकाश स्रोत प्रवास परख झिल्ली जो नकारात्मक बाद में गिना जाता है की सटीकता को प्रभावित कर सकते भीतर pores रोशन करेंगे।
5. मंच पर एक पूरा पलायन परख झिल्ली स्लाइड रखें। सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदर्शित वास्तविक समय छवि को देखते हुए, ज़ूम समायोजन दस्ता के साथ बढ़ाई समायोजित इतना है कि एक एकल झिल्ली के किनारों सिर्फ देखने के कैमरे के क्षेत्र के भीतर हैं।
  नोट: एक गिलास प्लेट पर स्लाइड रखकर ज़्यादा सफेद पृष्ठभूमि चरण के लिए यह आसान इमेजिंग के लिए स्लाइड पैंतरेबाज़ी करने के लिए बनाता है।
6. चित्रा 2A में दर्शाया आदर्श छवि के रूप में संभव के रूप में बारीकी से पुन: पेश करने के लिए प्रकाश स्रोत पदों (7.6.1) और जोखिम बार समायोजित करें। चमक के आधार पर, 5-60 एमएस के जोखिम बार पर्याप्त होना चाहिए।
  ध्यान दें:लक्ष्य के लिए संभव के रूप में छोटे पृष्ठभूमि रंग और छवि निष्ठा, यानी कम करने के बिना एक समान रूप से प्रबुद्ध झिल्ली, overexposure दिखाई कोशिकाओं का एक नुकसान के लिए अग्रणी के साथ एक छवि का उत्पादन होता है।
  1. स्लाइड के लिए एक कम कोण रिश्तेदार पर छोड़ दिया और सही प्रकाश स्रोतों की स्थिति। यह मदद मिलेगी पृष्ठभूमि दाग और रंगीन aberrations हटा दें। प्रत्येक प्रकाश स्रोत सीधे दूसरे के सामने रखने की कोशिश करें।
    नोट: स्थिति में प्रत्येक प्रकाश स्रोत के युद्धाभ्यास, वहीं अन्य बंद कर देते हैं। यह अपने आप और अधिक आसानी से और सही झिल्ली पर रोशनी के क्षेत्र केंद्र के लिए मदद करता है।
7. स्लाइड और सफेद संतुलन की छवि माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में एक बटन क्लिक का उपयोग निकालें।
  ध्यान दें: माइक्रोस्कोप अब calibrated है। भविष्य में उपयोग के लिए संभव के रूप में कई सेटिंग्स को बचाने और प्रकाश स्रोत की दशा और तीव्रता का ध्यान रखना।
8. छवि के अधिग्रहण और Flatfield
1. सॉफ्टवेयर के भीतर, सेटकब्जा फ़ोल्डर स्थान, और कब्जा झिल्ली प्रति एक छवि। के सामान्य टेम्पलेट निम्नलिखित छवियों नाम: वह नाम - ###, उदाहरण के लिए, नियंत्रण - 001.tif, नियंत्रण - 002.tif, परीक्षण दवा - 001.tif, और इतने पर।
  नोट: सबसे अच्छी छवि परिणामों के लिए, इस तरह के रूप में अन्य जेपीईजी हानिपूर्ण स्वरूपों पर झगड़ा के रूप में छवि फ़ाइल प्रकार बचाने के लिए।
  नोट: छवियाँ सामान्य टेम्पलेट अभी भी गिना जाएगा पालन नहीं लेकिन स्वचालित समूहीकरण और फ्लैट क्षेत्ररक्षण करने का विषय नहीं होगा।
  1. अगर flatfield सुधार वांछित है, प्रत्येक स्लाइड के लिए एक खाली क्षेत्र खोजने के लिए और नामकरण सम्मेलन के बाद एक रिक्त छवि ले: नाम - खाली।
    ध्यान दें: एक खाली स्लाइड है कि कोई झिल्ली में शामिल है और पृष्ठभूमि रोशनी का प्रतिनिधित्व करता है पर एक क्षेत्र है।
  2. इसके तत्काल बाद इमेजिंग से पहले, coverslip पर दबाव लागू करने के द्वारा एक झिल्ली समतल और संभव के रूप में कई फंस बुलबुले को दूर।
2. ImageJ में, प्लगइन्स के लिए जाने के लिए और टीसी प्लगइन खोलने; जैसे, प्लगइन्स> विश्लेषण> & #39; Transwell काउंटर '।
3. भीतर टीसी, 'Flatfield' बटन पर क्लिक करें और निर्देशिका चुनें संवाद बॉक्स निरीक्षण करते हैं। जहां झिल्ली छवियों बच गए फ़ोल्डर का चयन करें।
  नोट: केवल ऊपर सामान्य टेम्पलेट के साथ बचाया छवियों स्वचालित रूप से सही flatfield की जाएगी और चुने हुए फ़ोल्डर के भीतर Flatfield नामक एक नया फ़ोल्डर में सहेजा गया। एक flatfield सही छवि का एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 बी देखें।
9. विन्यास सेटिंग्स
1. ImageJ में एक प्रवास परख झिल्ली छवि ( 'फ़ाइल'> 'ओपन') और चित्र का चयन> समायोजित> 'रंग थ्रेसहोल्ड ...' खुला। समायोजित करने के लिए क्या रंग छवि से बाहर फिल्टर किया जायेगा रंग थ्रेसहोल्ड खिड़की का निरीक्षण करें।
  1. खिड़की के नीचे, सेट थ्रेशोल्डिंग विधि को 'शानबाग', 'सफेद' करने के लिए सीमा रंग, और रंग अंतरिक्ष 'आरजीबी' (लाल, हरे, नीले) के लिए कम से; अचयनित डार्क पृष्ठभूमि यदि चयन किया।
  2. शीर्ष समायोजित करेंक्लिक करके और 255 को 0 पर मार्कर और नीचे स्लाइडर्स खींचकर स्लाइडर्स (255 से नीचे स्लाइडर्स छोड़)। सुनिश्चित करें कि छवि पूरी तरह से सफेद है।
2. जब तक केवल नाभिक दिखाई दे रहे हैं, हरे और लाल शीर्ष स्लाइडर्स समायोजित करें।
  नोट: सेटिंग का चयन सेल का इस्तेमाल किया दाग पर पूरी तरह से अलग अलग होंगे। चित्रा -2 सी देखें।
3. टीसी प्लगइन में, इनपुट जुड़े विन्यास सेटिंग 'आरजीबी दहलीज' बक्सें में आरजीबी शीर्ष sliders के मूल्यों। 'जोड़ें / संशोधित' बटन पर क्लिक करें और विन्यास के ऊपर लिख।
  1. 1 पर आकार सीमा लोअर और अपर मूल्यों छोड़ दो - इन्फिनिटी।
4. विन्यास सेटिंग्स पैनल के भीतर, हार्ड ड्राइव करने के लिए सेटिंग्स में लिखने के लिए 'सहेजें' पर क्लिक करें।
10 गिनती छवियाँ और कैलिब्रेशन
1. टीसी प्लगइन (8.2) खोलें और 'गणना फ़ोल्डर' पर क्लिक करें और निर्देशिका चुनें संवाद बॉक्स निरीक्षण करते हैं। फ़ोल्डर का चयन करने के लिए एक गिना जाएन डी इंतजार इसे खत्म करने के लिए।
2. प्रत्येक गिना नमूना स्वचालित रूप से मुख्य तालिका में जोड़ा जाता है। प्रमुख स्तंभों 'गणना', 'गुणवत्ता', और 'जांचना?' कर रहे हैं।
  नोट: संयुक्त राष्ट्र के calibrated गणना क्षेत्र स्तंभ 'क्षेत्र रेंज' में दिखाया गया है भीतर की झिल्ली प्रति कणों की संख्या है।
  नोट: गुणवत्ता लगभग -0.8 1.7 से चलता है; क्यू ≥ 0.5 स्वीकार्य है।
  1. में एक checkmark का निरीक्षण करें 'जांचना?' आदर्श मेट्रिक्स को अपनी समानता पर आधारित स्तंभ अगर एक छवि जांच के लिए हरी झंडी दिखाई है।
    नोट: दोनों गुणवत्ता और कैलिब्रेशन कि वर्तमान सेटिंग्स संभवतः अपर्याप्त हैं सलाह दे सकते। उचित 'रंग थ्रेशोल्डिंग' और 'आकार पर्वतमाला' के बाद चयनित किया गया है और अंशांकन अभी भी सुझाव दिया है, मूल के निरीक्षण और गिना छवियों को एक वैध गिनती के अंतिम निर्धारक होना चाहिए।
3. टेबल कैलिब्रेशन के लिए चिह्नित में सभी नमूनों का चयन करें।
  1. टी में राइट क्लिक करेंवह मेज और चयन ब्योरा> 'आकार सुझाए गए'। यह एक सुझाव न्यूनतम कण क्षेत्र के साथ छवियों ब्योरा होगा।
  2. फिर से ठीक क्लिक करें और 'प्लॉट शो'। कण क्षेत्रों की आवृत्ति तितर बितर साजिश का निरीक्षण करें। एक आदर्श छवि एक ग्राफ एक लंबे सही पूंछ सामान्य वितरण, यानी, घंटी वक्र जैसी करनी होगी। चित्रा 3 बी देखें।
  3. अगर नमूना, राइट क्लिक का चयन, और ब्योरा> 'मैनुअल सेटिंग' का चयन करके, आवश्यक है, कम आकार सीमा को समायोजित करें। मैनुअल सेटिंग्स संवाद का निरीक्षण करें। इच्छित सेटिंग्स दर्ज करें और नई सेटिंग्स के साथ छवि ब्योरा गणना पर क्लिक करें।
4. मैन्युअल मायने रखता है समायोजित करने के लिए, नमूने का चयन करें, सही तालिका क्लिक करके, और 'की गिनती के साथ ओपन छवि' का चयन करें। प्रत्येक कण प्लगइन द्वारा गिना का प्रतिनिधित्व लाल मार्कर के साथ मूल छवि का निरीक्षण करें।
  नोट: ब्योरा> 'शो द्विआधारी छवि गिना' उपयोगी हो सकता है कि कैसे अच्छी तरह से जाँच करने के लिए मैंndividual कोशिकाओं रंग thresholding द्वारा हल किया जा रहा है।
  1. एक गिनती जोड़ने के लिए, Ctrl '' और क्लिक करें छोड़ दिया पकड़। कर्सर स्थान कि नमूने की कुल गिनती करने के लिए जोड़ दिया जाएगा पर एक मार्कर का निरीक्षण करें। एक मार्कर को निकालने के लिए सही छवि पर क्लिक करें। प्लगइन कर्सर के सबसे करीब मार्कर को हटा देगा।
  2. मार्कर के एक समूह को निकालने के लिए ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करने के ImageJ में एक चयन उपकरण का उपयोग करें। 'Ctrl' पकड़े, सही छवि पर क्लिक करें और रॉय के अंदर सभी मार्कर को हटा दिया जाएगा। 'गणना' कॉलम में सेल नंबर का निरीक्षण करें।
11. बचत / खोलने के लिए परिणाम और सीएसवी के लिए निर्यात
1. टीसी में, मेनू पट्टी करने के लिए जाने के लिए और 'फ़ाइल' पर क्लिक करें> 'सहेजें परिणाम'। परिणाम सहेजें डायलॉग बॉक्स का निरीक्षण करें। एक नाम और गंतव्य चुनें और 'सहेजें' पर क्लिक करें।
  1. 'ओपन परिणाम', सभी डेटा मुख्य तालिका में दिखाया गया है, जिसमें एक फ़ाइल लोड करने के लिए includin 'फ़ाइल' का प्रयोग करें>जी साजिश है।
    नोट: परिणाम फ़ाइल निर्देशिका छवियों में बच रहे हैं बचाता मूल छवियों को बचाने के कार्यों असफल हो जायेगी 'की गिनती के साथ ओपन छवि', 'ओपन मूल छवि' और बाद में ले जाया जाता है।।
  2. छवि निर्देशिका रीसेट करने के लिए, नमूने का चयन करें, सही मेज पर क्लिक करें और 'छवि निर्देशिका रीसेट' का चयन करें। निर्देशिका चुनें संवाद बॉक्स का निरीक्षण करें। नया फ़ोल्डर का चयन करें और अगर चित्र मौजूद हैं, निर्देशिका रीसेट हो जाएगा। परिणाम फ़ाइल को फिर से बचाने के लिए।
2. मेनू पट्टी में एक अल्पविराम अलग मान (CSV) फ़ाइल को सहेजने के लिए 'फ़ाइल'> '.csv में निर्यात करने के लिए' के लिए जाना। यह मतलब के साथ सांख्यिकीय समूहों में संगठित नमूने गिनती और मतलब की मानक त्रुटि के साथ एक फ़ाइल का उत्पादन; अपने लेआउट आम रेखांकन कार्यक्रमों में त्वरित रेखांकन के लिए बनाया गया है।
  नोट: सांख्यिकीय समूहों टीसी के भीतर बनाया समूहों पर आधारित हैं।
  1. नमूने सामान्य नामकरण टेम्पलेट का पालन करें, जीआर होने के लिए नमूने का चयनouped, ठीक क्लिक करें और चुनें 'ऑटो समूह'। यह वही एक ही समूह के 'नाम' के साथ नमूने कहते हैं। दोनों नियंत्रण 'इलाज' करने के लिए समूह 'नियंत्रण' और उपचार के लिए जोड़ा जाएगा: 1, नियंत्रण - - 2, उपचार - - 1, 2 उपचार उदाहरण के नियंत्रण का उपयोग करना।
  2. नमूने मैन्युअल समूहों के लिए डबल क्लिक करके समूह नाम में नमूना की 'समूह' सेल और टाइपिंग जोड़ें। नमूने का चयन इस समूह में शामिल कर सकता है, ठीक क्लिक करें और 'समूह में जोड़ें'।

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Representative Results

सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर

चित्रा 1 सीसीसी अंशांकन और गणनीय छवि अधिग्रहण की समग्र प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। चित्रा 1 ए और 1 बी पिक्सल में पी-वर्ग अंशांकन छवि और पी-वर्ग लंबाई की गणना को दर्शाती है। सीसीसी सूत्र का उपयोग कर एक निश्चित मात्रा में सेल एकाग्रता निर्धारित करता है:

1 समीकरण

एक hemocytometer के पी वर्ग 100 नाथन की मात्रा (1 मिमी x 1 मिमी x 0.1 मिमी) और यह देखते हुए निरंतर, कुल छवि मात्रा मिमी के लिए पिक्सल परिवर्तित करने के बाद गणना की जा सकती है। चित्रा 1C में फोकस कोशिकाओं विशेषता चरण रोशनी और कोई पृष्ठभूमि hemocytometer graduations प्रदर्शित करने के साथ एक आदर्श गणनीय छवि है। अंत में, Figur के तितर बितर साजिशई -1 डी एक अत्यधिक सहसंबद्ध, विभिन्न प्रयोगों और HTR8, ते -2, और Swan71 सहित प्रकार की कोशिकाओं पर ले लिया 57 छवियों से कोशिकाओं की गिनती स्वचालित बनाम मैनुअल पता चलता है। ध्यान से, एकाग्रता की ऊपरी सीमा ~ 2.3 x 10 ³ कोशिकाओं / एमएल (≈ 5 छवि प्रति कोशिकाओं) के एक कम अंत के साथ ~ 5.6 x 10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल था। यह सुझाव दिया है कि अगर मायने रखता छवि प्रति 10-15 कोशिकाओं से नीचे हैं, नमूना एक छोटी मात्रा में निलंबित किया जाना चाहिए सांख्यिकीय शक्ति बढ़ाने के लिए।

अधिग्रहण और चित्रों के प्रसंस्करण प्रवासन परख काउंटर के लिए

पलायन परख झिल्ली के सैकड़ों कई प्रयोगों, जो सभी के मानव ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइन HTR8, Swan71, या डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन ते-2 के साथ वरीयता प्राप्त थे पर imaged थे। इन चित्रों के, कई उत्कृष्ट चमक, स्पष्टता और staine के रंग के आधार पर गुणवत्ता के लिए बहुत ही गरीब से श्रेणियों की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुने गए हैंडी कोशिकाओं, और पृष्ठभूमि धुंधला और अवांछित कणों (शोर) की डिग्री। इन छवियों का उपयोग करना, डिफ़ॉल्ट आरजीबी दहलीज रंग सेटिंग्स (≈ 150, 120, 0) निर्धारित किया गया है (चित्रा -2) और एल्गोरिथ्म के बाद के सभी घटनाओं में एक आधार रेखा के रूप में इस्तेमाल किया। लक्ष्य कुल रंग अनुपात, यानी करने के लिए परमाणु रंग अधिकतम करने के लिए किया गया था, रंग पिक्सल के बहुमत सेल नाभिक के भीतर होना चाहिए। चित्रा 2A में ऊपरी पैनल आदर्श छवि चमक, सेल नाभिक स्पष्टता और रंग, और नगण्य पृष्ठभूमि शोर को दर्शाया गया है। छवि की चमक सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण सेल और पृष्ठभूमि के बीच एक बड़ा पर्याप्त विपरीत एक काले और सफेद द्विआधारी छवि का निर्माण करने के लिए नहीं है।

इस अंतर को पूरा नहीं किया जाता है तो बड़े या अप्रत्याशित क्षेत्रों ImageJ द्वारा गिना जा सकता है कण समारोह का विश्लेषण; सबसे अच्छी स्थिति एक पूरी तरह से सफेद पृष्ठभूमि है। विरोध में, फाई के निचले पैनलआंकड़ा 2A चरम पृष्ठभूमि धुंधला और कोशिकाओं है कि लगभग अप्रभेद्य हैं। धुंधला की इस डिग्री के साथ झिल्ली की संभावना सबसे अधिक पलायन परख काउंटर से अविश्वसनीय परिणाम देगा।

कुछ उदाहरणों में, आदर्श स्तर पर चमक बढ़ाने की छवि overexposing द्वारा छवि निष्ठा प्रभावित कर सकता है। इसी तरह, उच्च जोखिम या चमक प्रगतिशील या अनियमित प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों के साथ प्रणालीगत रंगीन प्रभाव का उत्पादन कर सकता है। Flatfield सुधार के साथ, इन प्रभावों को कम से कम या के रूप में चित्रा 2 बी (ऊपरी बनाम कम पैनल) में दिखाया गया है पूरी तरह से हटाया जा सकता है। इसके अलावा, flatfield सुधार कई झिल्ली छवियों की चमक बराबर करने के लिए एक अच्छा तरीका है।

कैलिब्रेशन और प्रवासन परख काउंटर के मान्यकरण

हमें सहायता करने के लिएएर बेहतर निर्धारण करने प्रवास परख झिल्ली छवियों सटीक गिनती के लिए आवश्यक मानदंडों को पूरा करता है, तो में दो क्वालिफायर डिजाइन किए गए थे, कहा जाता छवि गुणवत्ता (क्यू), और अंशांकन सिफारिश (सीआर)। महत्वपूर्ण बात है, दोनों क्वालिफायर, नाम सीआर पता चलता है, बल्कि प्रत्येक छवि के countability का पूर्ण न्यायाधीशों की तुलना में मार्गदर्शक के रूप में केवल सिफारिशों और कार्य कर रहे हैं। दोनों क्यू और सीआर कण क्षेत्र (10.3.2) की आवृत्ति तितर बितर साजिश की मैट्रिक्स के आधार पर कर रहे हैं। सरलीकरण के लिए, एक मीट्रिक वक्र के विभिन्न आकृतियों है कि आवृत्ति साजिश को बनाने के रूप में माना जा सकता है। एक पर्याप्त क्यू (≥0.5) के वांछित मीट्रिक सेल आकार का मनाया अनुमानित सामान्य वितरण द्वारा निर्धारित किया गया था। आमतौर पर, कोशिकाओं है कि एक दूसरे से unresolvable हैं, अधिक से सना हुआ है, या बस विशेष रूप से बड़े, skewedness एक सही पूंछ सामान्य वितरण (चित्रा 3 बी) के लिए पाली। जैसे, यह एक विशिष्ट calibrated छवि के आदर्श मीट्रिक है। साथ मेंपृष्ठभूमि शोर के अलावा, यह आम तौर पर 1-5 पिक्सेल क्षेत्र रेंज (चित्रा 3 ए) में कणों की एक बड़ी संख्या को जाता है। आदेश साजिश मीट्रिक की गणना करने के लिए, डेटा दस Savitzky-Golay डॉ माइकल थॉमस फ्लानागन की जावा वैज्ञानिक पुस्तकालय (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga द्वारा उत्पादित बहुपद डिग्री भिन्न की smoothed घटता के साथ लगे हैं /जावा/)। मूलतः, यह प्रत्येक extremum की अनुमानित क्षेत्र में कई बिंदुओं बनाता है। स्थानीय minima और Maxima का घनत्व क्लस्टर नक्शे की एक श्रृंखला के माध्यम से, भूखंड मैट्रिक्स की एक सामान्य तस्वीर एक आदेश सूची, यानी, न्यूनतम, अधिकतम, न्यूनतम / अधिकतम ओवरलैप करते हैं, ..., एन ^वें extremum के रूप में गणना की जा सकती। संक्षेप में, डिग्री है जो smoothed घटता आवृत्ति डेटा निर्धारित करता है कि कसकर Extrema अंक हैं पैक फिट करने के लिए। अधिक से अधिक गैर अतिव्यापी Extrema की क्लस्टरिंग, अधिक से अधिक क्यू हो जाता है। सिद्धांत रूप में, क्यू टी पर आधारित समग्र छवि स्पष्टता का प्रतिनिधित्व करता हैवह अलग कण आकार के वितरण।

चाहे बूलियन सीआर सच है या नहीं Extrema के क्रम पर निर्भर करता है। चित्रा 3 ए से, आदेश दिया सूची न्यूनतम, अधिकतम, और Savitzky-Golay वक्र के गुणों पर आधारित Extrema ओवरलैपिंग के एक दृश्य होगा। चूंकि चित्रा 3 ए, एक uncalibrated छवि, Extrema झंडे सीआर सच के रूप में के इस सामान्य अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है उपयोगकर्ता उस छवि अंशांकन आवश्यकता हो सकती है के लिए सुझाव दे। आगे चल रहा है, यह देखा जा सकता है कि चित्रा 3 बी से, इस सूची में समान लेकिन पहले कम से कम के बहिष्कार के साथ होगा। इस प्रकार आदर्श uncalibrated और कैलिब्रेटेड छवियों के मेट्रिक्स निर्धारित किया गया है। इन मेट्रिक्स से विचलन आम तौर पर जांच के लिए एक छवि झंडा और ऐसे चित्रा -3 सी में उच्च पृष्ठभूमि शोर झिल्ली के साथ मामले के रूप में क्यू ≤ 0 को कम करने, होगा। एक चयन करने के लिए इन क्वालिफायर को लागू करनेउत्कृष्ट छवियों, चमक और पृष्ठभूमि शोर के साथ संबंध को मामूली रूप से, यह स्पष्ट है कि कैलिब्रेटेड की छवि मायने रखता काफी uncalibrated से मार्गदर्शन की गिनती के लिए करीब (± 2.9 1.9% ± 0.3 बनाम 21.7%, क्रमशः, चित्रा 3 डी, ई) कर रहे हैं। विश्लेषण के लिए चुना छवियों के समग्र उच्च गुणवत्ता (uncalibrated को देखते हुए 2 समीकरण = 0.71 ± 0.04; मतलब ± एसई), वहाँ था अंशांकन निम्न केवल क्यू में एक आशा की मामूली वृद्धि ( = 0.90 ± 0.04)। साथ में ले ली, क्यू पता चलता है, जबकि सीआर एक छवि के समग्र countability संभावित कि क्या अंशांकन सफल है या नहीं का एक मजबूत संकेत है।

दोनों सेल एकाग्रता काउंटर और प्रवासन परख काउंटर की तुलना समय

चित्रा -4 ए उपयोगकर्ता 1 और 2 के बीच तुलना सीसीसी अंशांकन समय, उपयोगकर्ता 1 में काफी तेजी से प्रयोक्ता 2 की तुलना में एक साथ था, सीसीसी जांच के लिए औसत लगभग पांच मिनट पर ले जा रही है। मैन्युअल hemocytometer गिनती और स्वचालित दरों की तुलना में, एक मिलान काउंटर का उपयोग कर गिनती के मैनुअल दर समय यह hemocytometer चैम्बर के नौ चित्र लेने के लिए ले लिया की तुलना में और सीसीसी (चित्रा 4 बी) में गिना गया। 1.15 x 10 ⁶ कोशिकाओं का एक विशिष्ट सेल एकाग्रता / एमएल समय की तुलना करने, throughput में 1x वृद्धि के एक औसत करने के लिए अग्रणी इस्तेमाल किया गया था। इस दर में भरी हुई कोशिकाओं की संख्या के आधार पर अलग अलग होंगेकुल समय छवियों पर कब्जा करने और उन्हें प्रक्रिया के लिए ले जाया के रूप में hemocytometer सेल नंबर से स्वतंत्र है।

अन्त में, झिल्ली, टीसी के भीतर मात्रा का ठहराव, और इन चित्रों के मैनुअल समायोजन की छवि अधिग्रहण को शामिल समय चित्रा 4C में मापा गया था। उल्लेखनीय है कि 12 कम सेल नंबर (कुल = 10,571 कोशिकाओं) और पर्याप्त पृष्ठभूमि धुंधला और सेलुलर मलबे के साथ प्रवास परख झिल्ली एक सबसे खराब स्थिति यह है कि सेल नंबर के लिए मैनुअल समायोजन की आवश्यकता होगी की सुविधा के लिए चुने गए हैं। यह चित्रा 4C समायोजन (adj) कॉलम में जहां यह 13 मिनट की एक औसत ले लिया अवांछित मायने रखता हटाने और चूक कोशिकाओं को जोड़ने के लिए जा सकता है। मैनुअल गिनती की तुलना के लिए, इष्टतम सेल गिनती दरों सेल काउंटर के साथ निर्धारित किया गया है; उच्च सेल घनत्व के साथ उच्च गुणवत्ता झिल्ली छवियों का उपयोग किया गया (परिणाम दिखाया गया है)। इस उपयोगकर्ता 1 और 2 9.1 x 10 ³ कोशिकाओं / घंटा की बीच एक औसत अधिकतम दर झुकेंगे(~ 2.5 कोशिकाओं / एस)। इन नंबरों का उपयोग, चित्रा 4C से झिल्ली 4.4x से अधिक से अधिक मैनुअल दर से उम्मीद होगी साथ टीसी तेजी से गिना रहे थे। समय की बचत, सीधे सेल नंबर और छवि गुणवत्ता पर निर्भर कर रहे हैं पलायन झिल्ली कि कम या कोई समायोजन और उच्च घनत्व सेल (~ 7000 कोशिकाओं / झिल्ली) की आवश्यकता की गणना के द्वारा, टीसी उत्पन्न कोशिकाओं की गिनती तेजी से अधिक से अधिक मार्गदर्शन की दर से 1,395x।

आकृति 1
चित्रा 1: सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर। Hemocytometer 40X कुल बढ़ाई लिया के केंद्रीय प्राथमिक वर्ग के (ए) चरण विपरीत माइक्रोग्राफ। स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) ए (ए) से छवि के संस्करण फसली क्या लंबाई hemocytometer पर मापने के लिए चित्रण। परिणाम विंडो लंबाई स्तंभ आसान पहचान के लिए डाला गया था। पीली पट्टी= 1 मिमी। (सी) एक hemocytometer 1600 x 1,200 पिक्सल के एक संकल्प के साथ 40X कुल बढ़ाई माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर अंशांकन के बाद HTR8 कोशिकाओं से युक्त का एक आदर्श माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (डी) एक तितर बितर साजिश का मार्गदर्शन ही छवियों सेल एकाग्रता कैलकुलेटर का उपयोग करने का स्वचालित मायने रखता है की तुलना में ImageJ प्लगइन सेल काउंटर का उपयोग मायने रखता है की तुलना। एन = 57 छवियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रवासन परख प्रतिनिधि छवियों का मुकाबला। (ए) ऊपरी पैनल कुल झिल्ली कम से कम पृष्ठभूमि के साथ एक आदर्श छवि चित्रण की एक एक आठवें भाग है; स्केल बार = 200 माइक्रोन।कम पैनल कि गंभीर रूप से स्वत: गिनती की सटीकता को प्रभावित करता है महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि धुंधला के साथ एक छवि होता है; स्केल बार = 585 माइक्रोन। (बी) ऊपरी पैनल अच्छी गुणवत्ता जो गलत मायने रखता उत्पादन के एक अंधेरे छवि का प्रतिनिधित्व करता। नीचे पैनल flatfield सुधार के बाद ही छवि के एक गणनीय संस्करण है। स्केल सलाखों = 593 माइक्रोन। (सी) ऊपरी पैनल का प्रतिनिधित्व करता है एक में बढ़कर एक ठेठ झिल्ली का दृश्य। कम पैनल वांछित ImageJ रंग thresholding द्वारा पीछा किया एक ही छवि है (आरजीबी सीमा = 150, 120, 0) कहनेवाला पृष्ठभूमि और जाहिरा दाग कोशिका द्रव्य के बहुमत हटा दें। सभी छवियों 2,592 x 1,944 पिक्सल के एक संकल्प के HTR8 के कई प्रवास परख हमलों hematoxylin के साथ दाग से कम से एक calibrated विदारक गुंजाइश के साथ 1.35X कुल बढ़ाई पर ले जाया गया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3: कैलिब्रेशन और प्रवास परख ग ounter का सत्यापन। (ए) उच्च गुणवत्ता की एक uncalibrated छवि के विशिष्ट उदाहरण है। (बी) (ए) के calibrated संस्करण प्रवास परख काउंटर का ब्योरा> 'सुझाए गए आकार' का उपयोग कर। (सी) महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि दाग या समग्र अंधेरे के साथ एक कम छवि गुणवत्ता झिल्ली का एक विशिष्ट आवृत्ति साजिश है। (डी) एक तितर बितर साजिश का मार्गदर्शन ImageJ प्लगइन सेल काउंटर और प्रवास परख काउंटर स्वचालित गिनती का उपयोग मायने रखता है की तुलना। (ई) एक बार बनाम uncalibrated स्वचालित मायने रखता है calibrated की औसत प्रतिशत का अंतर दिखा ग्राफ। डेटा मतलब ± एसई कर रहे हैं। पी <0.0001, एन = 30, वेल्च के साथ Corre unpaired टी परीक्षणction। एक ही छवियों विकास के लिए इस्तेमाल किया गया है और दोनों के ई कैलिब्रेशन ब्योरा> 'सुझाए गए आकार' और ब्योरा> साथ किया गया था 'मैनुअल सेटिंग' के आगे न्यूनतम आकार और रंग की गिनती की सीमा को निखारने के लिए। कोई मैन्युअल गिनती समायोजन समारोह 'की गिनती के साथ ओपन छवि' का उपयोग किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: सेल एकाग्रता काउंटर और प्रवास परख काउंटर उपयोग के समय। (ए) सीसीसी अंशांकन बार की तुलना (चरण 1 और 2) 1 (सीसीसी / टीसी विशेषज्ञ) और उपयोगकर्ता 2 (सीसीसी / टीसी नौसिखिया) के बीच। (बी) मैनुअल सेल गिनती बार पांच परीक्षणों पर औसतन प्रति मिनट और गिना कोशिकाओं में व्यक्त किया गया। automatiसी मायने रखता औसत बार द्वारा गणना एक hemocytometer चैम्बर के नौ छवियों पर कब्जा करने और सीसीसी के साथ गिना रहे थे। सेल का इस्तेमाल किया एकाग्रता ~ 1.15 x 10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल था। डेटा मतलब ± एसई कर रहे हैं। एन = 5 (सी) Transwell काउंटर समय तीन से अधिक श्रेणियों की तुलना में थे:;, मात्रा का ठहराव प्राप्ति (चरण 7 और 8 ACQ) (QNT; डिफ़ॉल्ट विन्यास सेटिंग्स का उपयोग 10.1-10.3.3 कदम), और मैनुअल समायोजन (adj; 10.4 कदम -1.4.2)। झिल्ली मात्रा निर्धारित क्रम में सही मायने रखता है के लिए पर्याप्त मैनुअल समायोजन की जरूरत के लिए पृष्ठभूमि धुंधला और मलबे का एक उच्च डिग्री था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

गंभीर कदम, समस्या निवारण, और सीमाएं

स्वचालित कम्प्यूटेशनल विधियों के स्वभाव, विशेष कण विश्लेषण के उन लोगों के, इन कणों को परिभाषित करने के लिए गणितीय क्षमता जरूरी है। नतीजतन, दोनों सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर और प्रवास परख काउंटर की सटीकता बारीकी से कैसे कब्जा कर लिया छवि सेल नमूना या प्रवास परख झिल्ली जैसा दिखता है, majorly छवि निष्ठा पर निर्भर है, कि है। यह अत्यंत महत्व माइक्रोस्कोप और संभव के रूप में सबसे अच्छा के रूप में जुड़े सॉफ्टवेयर अंशांकन प्रोटोकॉल का पालन करने की इसलिए है। इस पृष्ठभूमि शोर सीमित अवांछित कणों को कम करने, उज्ज्वल और समान रूप में फोकस छवियों पर कब्जा करने, और इस तरह के मनमुटाव के रूप में गैर हानिपूर्ण फ़ाइल स्वरूपों में बचत भी शामिल है। इस प्रकार, दोनों plugins गलत परिणाम का उत्पादन करने के लिए अगर इन आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर रहे संभावना है। यह निर्धारित करने के लिए दोहरी जांच कोशिकाओं की गिनती करने के लिए इसलिए हमेशा अच्छा अभ्यास है, तो वे दृश्य उम्मीदों से मेल जब संदेह मेंटी। यदि वास्तव में परिणाम मेल नहीं खाते, द्विआधारी छवि के साथ मूल छवि की तुलना मुद्दा (10.4 नोट) को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। कुछ मामलों में, गहरे रंग की परख प्रवास छवियों बड़े क्षेत्रों है कि रंग सीमा के भीतर गिरने पिक्सेल मूल्यों के कारण गिना दिया है हो सकता है। सामान्य में, एक flatfield छवि का उपयोग कर अंधेरे और blotchiness हटाने और रंगीन अनियमितताओं के कारण सबसे अधिक मायने रखता है अवांछित पाएगा।

ये संभव है और अपेक्षाकृत सामान्य समस्याओं को देखते हुए यह प्रकृति प्रकाशन समूह और अन्य लोगों के ¹³ से प्रस्तावित उन लोगों की तरह मानक छवि अखंडता दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। मायने रखता है अनुरूप रखने के लिए, एक छवि के लिए किसी भी समायोजन सब दूसरों के लिए समान रूप से लागू किया जाना चाहिए। यह भी शामिल है, लेकिन इसके विपरीत, संतृप्ति, चमक, लाभ ही सीमित नहीं है, इस तरह के औसत और कुशाग्रता, रंग और फिल्टर के रूप में फिल्टर। गामा का समायोजन से परहेज किया जाना चाहिए क्योंकि यह पिक्सेल रंग की एक गैर रेखीय परिवर्तन लागू होता है और इसलिए प्रत्येक छवि अलग प्रभावित कर सकता हैLy ^14। जब कुछ कोशिकाओं के साथ छवियों के लिए एक आम जोखिम समय आवेदन करने वाले (<1000), इस overexposure और छवि निष्ठा की हानि हो सकती है। इसके विपरीत, कोशिकाओं के हजारों के साथ एक झिल्ली अपूर्ण फोटो को रोकने के लिए उच्च जोखिम बार की आवश्यकता होती है सकते हैं। तदनुसार, यह संभव के रूप में छोटे, और केवल जब आवश्यक के रूप में छवियों को समायोजित करने के लिए, उच्चतम छवि निष्ठा प्राप्त बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा अभ्यास है।

यहां तक कि एक उच्च निष्ठा छवि के साथ, सच कण मायने रखता गंभीर रूप से अवांछित कणों से विषम हो सकता है। सेल एकाग्रता कैलकुलेटर का उपयोग कर, एक नमूना सेल मलबे की काफी मात्रा में होता है, तो निलंबित कोशिकाओं के उन लोगों के लिए इसी तरह के क्षेत्रों के लिए विशेष रूप से, इस परिणाम को तिरछा कर सकते हैं। कुछ मामलों में, यह स्वचालित विश्लेषण को रोकने सकता है, तो मलबे को कम से कम नहीं किया जा सकता। इसी तरह, प्रवास परख झिल्ली कि इसी तरह के रंग की पृष्ठभूमि धुंधला के उच्च स्तर होते झिल्ली की पीठ से कोशिकाओं या unremoved कोशिकाओं दाग है, संभावना है कि मैं उत्पादन होगाn ठीक परिणाम है। इन अवांछित कणों सामान्य रूप से कुछ मायनों में हटाया जा सकता है: प्रकाश स्रोत चमक या जोखिम समय बढ़ रही है, रंग thresholding को संशोधित करने और अधिक कठोर, या मैन्युअल 'की गिनती के साथ ओपन छवि' (10.4) के माध्यम से हटाया जा सके। यह ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल सीसीसी और टीसी के लिए आवश्यक सटीकता बनाए रखने के लिए छवि का इष्टतम गुणवत्ता का उत्पादन महत्वपूर्ण है। हालांकि, टीसी काफी कम गुणवत्ता, अलग-अलग आवर्धन, या अलग रंग के धब्बे की छवियों की गिनती, आम तौर पर केवल अधिक समय मैनुअल समायोजन (10.4) पर खर्च की आवश्यकता के लिए सक्षम है।

किसी भी प्रवास परख झिल्ली की छवि की जांच के दौरान यह ध्यान में छवि का संकल्प और कोशिकाओं के सापेक्ष आकार लेने के लिए महत्वपूर्ण है। पहले से वर्णित है, छवि गुणवत्ता (क्यू) और कैलिब्रेशन सिफारिश (सीआर) कण क्षेत्र की आवृत्ति साजिश मेट्रिक्स पर निर्भर हैं। विश्लेषण किया छवियों के, प्रत्येक कोशिका पर औसत 1 / 100,000 से ऊपर ले जाता हैकुल छवि क्षेत्र। पिक्सल का सिर्फ लाखों लोगों की छवियों को एक छोटे सेल आकार के अनुपात के साथ उपयोग करते हुए, सेल आकार में बदलाव भी छोटा है। यही कारण है कि विचरण केवल 10-60 पिक्सल से लेकर कर सकते है। लेकिन जैसा कि छवि क्षेत्र अनुपात करने के लिए सेल क्षेत्र बड़ा हो जाता है, सेल के वितरण बढ़ जाती है आकार, कोई भी क्षेत्र की आवृत्ति कम से सेल का आकार सामान्य वितरण की कुकुदता को कम करने। बदले में यह सेल क्षेत्र के स्वचालित गणना के लिए और अधिक कठिन या असंभव बना सकते हैं क्योंकि एक निश्चित न्यूनतम क्षेत्र निर्धारित नहीं किया जा सकता है। इसी तरह, यह भी कोशिकाओं की कुछ संख्या के साथ छवियों के लिए लागू होता है जहां अलग सेल आकार की आवृत्ति बहुत कम हो सकता है (<50)। नतीजतन, जब इस अध्ययन या सेल आकार के विभिन्न वितरण में इस्तेमाल उन लोगों की तुलना में विभिन्न प्रस्तावों के साथ छवियों का विश्लेषण, सेल आकार सीमा के मैनुअल पहचान जरूरत हो सकती है (10.3.3)।

महत्व और भविष्य के निर्देश

ImageJ प्लगइन सेल काउंटर शुरू में RELE थाडॉ कर्ट डी वोस द्वारा 2001 में ased और इस दिन के लिए मैनुअल सेल गिनती के लिए एक प्रधान के रूप में कार्य किया है। जैविक समुदाय के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरणों की प्रवृत्ति को जारी रखने के लिए, सेल एकाग्रता कैलक्यूलेटर और प्रवास परख काउंटर नि: शुल्क उपकरण में अगले कदम मदद करने के लिए throughput और प्रवास assays के अंतर-प्रयोगात्मक reproducibility बढ़ाने की पेशकश करते हैं। पलायन assays के अंतिम परिणाम पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या अत्यधिक निर्भर है। फलस्वरूप एक विश्वसनीय कोशिका गिनती reproducibility के लिए एक जरूरत है। इस तरह, सीसीसी दोनों सेल एकाग्रता और कम गिनती बार सेल स्वास्थ्य संरक्षण के उच्च सांख्यिकीय निश्चितता के कारण सटीकता की वृद्धि हुई है।

इसके अलावा, दोनों plugins के अंतिम परिणाम सेल संख्या की गिनती नहीं है और इस तरह के प्रतिदीप्ति के रूप में एक रिश्तेदार सूचकांक है। विभिन्न अन्य प्रोटोकॉल धुंधला करने के बाद कि उपाय प्रतिदीप्ति मौजूद हैं, लेकिन इन तरीकों संवेदनशीलता ¹³ की कमी से पीड़ित हैं। एडोब फोटोशॉप के लिए अपने स्वयं के कण विश्लेषण टी प्रदान करता हैool लेकिन कार्यक्रम उपयोग के लिए खरीदा जाना चाहिए और बाद मतगणना विश्लेषण प्रवास परख काउंटर ²⁰ से उपलब्ध प्रस्ताव नहीं है। दोनों plugins ImageJ से कण गिनती सुविधा पर भरोसा करते हैं और फलस्वरूप ImageJ द्वारा इस्तेमाल के लिए मैक्रो को संपादन करके अंत उपयोगकर्ता द्वारा संशोधित किया जा सकता है। इस उपयोगकर्ता के नए मैक्रोज़ बनाने के द्वारा अन्य कणों के लिए plugins के दायरे का विस्तार करने के लिए अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करता है। इसके अलावा विकास गणनीय कणों की चौड़ाई बढ़ाने के लिए और अंत उपयोगकर्ता के योगदान को शामिल करने के लिए अगले तार्किक कदम है। एक स्वचालित मतगणना एल्गोरिथ्म और बाद मतगणना विश्लेषण के साथ सेल काउंटर के मूल सिद्धांतों के संयोजन से, यह बहुत आसानी के साथ जो पलायन assays सटीकता के किसी भी हानि के बिना संसाधित किया जा सकता बढ़ जाती है। http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: plugins से स्थापना के निर्देश के साथ डाउनलोड के लिए आसानी से उपलब्ध हैं।

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm² growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm²
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO₂, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required

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References

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Biology

स्वचालित मात्रा का ठहराव और सेल गिनती प्रक्रिया ImageJ plugins का उपयोग का विश्लेषण

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