Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

Abstract

El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados ​​sin pérdida de precisión.

Introduction

En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y ^1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas ^3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ventaja de las células resistencia eléctrica para determinar el número y tamaño de las células. Ellos son rápidos, precisos y más barato que los citómetros de flujo. Sin embargo, rara vez se utilizan sólo para el recuento de células debido a su costo considerable en comparación con el conteo manual ^3. Citómetros de flujo, por otro lado, son caros pero tienen muchas aplicaciones tales como el recuento de células, el análisis de la forma de las células, structure y la célula de medida interna Marcadores de ^4,5. Las máquinas que utilizan cualquiera de estos dos principios están disponibles de muchos fabricantes. Conteo manual es asequible, pero consume tiempo y sujeto a un sesgo, mientras que los métodos automatizados vienen con una fracción del tiempo necesario para que el recuento manual, pero el uso de máquinas costosas ^6.

Otros procedimientos de cultivo celular común están en ensayos de motilidad de las células in vitro, a saber, la migración celular y la invasión ^7. ensayos de migración y la invasión se utilizan comúnmente para investigar la motilidad celular y la invasión en respuesta a una respuesta quimiotáctica. Además, se utilizan ampliamente para estudiar el desarrollo embrionario, la diferenciación, la respuesta inflamatoria, y la metástasis de múltiples tipos de células ^7-11. Las células que han migrado o invadido través de la membrana porosa de un ensayo de migración se pueden cuantificar de dos maneras diferentes. En primer lugar, mediante la tinción de las células con un colorante fluorescente, la disociación from de la membrana, y la cuantificación utilizando un lector fluorescente ^12. Una limitación de este método de cuantificación es que ningún registro puede ser retenido de las membranas y no hay posibilidad de un mayor análisis ^13. El segundo método de cuantificación es para emigrado / células para ser fijados y teñidos con colorante fluorescente o más comúnmente, con colorantes citológicos como cristal violeta, colorante azul de toluidina o hematoxilina invadió; a continuación, las células se cuantificaron utilizando manualmente las imágenes microscópicas invertidas de estas membranas, que es una tarea que consume mucho tiempo ^12,13.

Para superar los inconvenientes de conteo de células manual, se desarrollaron dos contadores de células automatizadas fiables y precisos para la concentración de células y para el ensayo de migración. Estos algoritmos contador de células automatizado fueron desarrollados para ImageJ como un plugin usando lenguaje de programación Java de Oracle. ImageJ es una herramienta de procesamiento de imagen pública y ampliamente usada desarrollado por el Instituto Nacional del ciLTH (NIH) ^14,15; por lo tanto, escribir estos plugins para ImageJ facilita una fácil integración en la comunidad biológica.

Automatización de recuento de células garantiza un alto rendimiento y reproducibilidad en comparación con el conteo manual. Aunque otro software y plugins disponibles se pueden utilizar para calcular la concentración de células a través de análisis de imágenes ^5,16,17, Cell Concentración Calculadora Plugin es rápido y también puede manejar diluciones de células y tratamientos. Por otra parte, todos los resultados y cálculos de estos dos contadores se pueden guardar y exportar. Los dos plugins descritos en este documento están optimizados para el uso de un microscopio de contraste de fases de imágenes de células vivas y gran campo de visión (toda la captura de membrana) de imágenes para membranas de ensayo de migración a través del uso de un microscopio de disección. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocol

Microscopio 1. El compuesto y la configuración de la cámara (Simulador de concentración de células)

1. Aumentar el brillo de la bombilla al completo con la perilla de ajuste de luz, cambiar a la lente del objetivo 4X, y los filtros de contraste de fase se seleccionan aseguran.
   NOTA: Cualquier microscopio de contraste de fase invertida para el cultivo de tejidos con un fondo oscuro, por ejemplo, de contraste de fase PHP, pueden ser utilizados siguiendo los procedimientos del microscopio y la cámara estándar.
2. Dentro del software del microscopio, establecer los ajustes de captura de imagen a los valores predeterminados.
   NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para encontrar la ubicación de estos ajustes.
   1. Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
      NOTA: En función del software, 'brillo' y el 'contraste' pueden por defecto a un valor de 0% en lugar del 100%.
   2. imágenes dispuesto a ser capturados en blanco y negro usando la más alta resolución available (1.600 x 1.200 píxeles (px) o mayores).
      NOTA: Un "saturación" de 0% es suficiente si un ajuste blanco y negro no está disponible.
3. Colocar un hemocitómetro estándar sobre la platina del microscopio y capturar una imagen como se representa en la (Figura 1A); esta es la "imagen de calibración de volumen '. Ajustar los tiempos de exposición según sea necesario.

Calibración Volumen 2. Imagen

1. ImageJ abierto y en el menú de plugins, iniciar la Calculadora de concentración de células (CCC) plugin, por ejemplo, "Calculadora Concentración teléfono ', Complementos> Analizador>.
   1. Si el panel del lado derecho 'imagen de volumen de calibración' no es visible, haga clic en "Calibrar" para mostrarlo.
2. En ImageJ, abra la "imagen de calibración volumen" en el paso 1.3 ( "Archivo"> ​​"Abrir") y en el CCC clic en el botón 'Get dimensión de la imagen'.
   NOTA: Esto llenará en tanto y anchura de imagencuadros de texto Altura con la resolución de la imagen en píxeles de forma automática.
3. En ImageJ, seleccione la "Herramienta de Línea Recta 'junto a las herramientas de selección y dibujar una línea recta a través de toda la longitud del hemocitómetro primario (P) -square demostrado en la (Figura 1B) haciendo clic y arrastrando el cursor.
   1. Presione la tecla "M" para mostrar la ventana de resultados con las mediciones de línea recta. Escriba el valor de la columna de longitud en el cuadro de texto 'P-cuadrado Longitud' en CCC (Figura 1B).
   2. Haga clic en el botón 'Calcular imagen de volumen' a la salida del volumen de la imagen en el cuadro de texto imagen de volumen. Alternativamente, si el volumen de la imagen ya se sabe, escriba el volumen en nL en el cuadro de texto imagen de volumen.
4. Haga clic en el botón "Guardar".
   NOTA: El plug-in está calibrada.

La calibración de la cámara 3. Exposición

1. Después de la recolección de células paracontando a través de hemocitómetro, carga de 10 l de células en una cámara del hemocitómetro y colocarlo en la platina del microscopio.
2. Usando la misma configuración desde el paso 1.2, ajustar el tiempo de exposición para que las líneas de fondo de la hemocitómetro desaparecen.
   1. Ajuste el enfoque de modo que el interior de las células es más oscuro que la membrana celular, lo que indica enfoque dentro de la sección transversal central de la célula y no los polos.
   2. Ajustar aún más la exposición de manera que las células no están sobreexpuestas y se asemejan a los que se representan en la (Figura 1C).
      NOTA: Las líneas del hemocitómetro ligeramente visible son aceptables. Se recomienda guardar o registrar estos ajustes para mantener la precisión y reproducibilidad.

4. Adquisición de imágenes

1. Para cada muestra de células, carga de 10 l en ambas cámaras del hemocitómetro para aumentar la potencia de la inferencia estadística ^2. Coloque el hemocitómetro en la platina del microscopiopara formación de imágenes.
   NOTA: La resolución y magnificación de cada imagen deben ser los mismos la "imagen de calibración de volumen 'como. El plug-in cuenta todas las imágenes de cualquier carpeta seleccionada; mantener las imágenes que se cuentan juntas en la misma carpeta.
   1. Si una función de nombre de archivo incremento automático está disponible, encenderlo y asegúrese de que cada imagen no se muestra después de la captura para aumentar el rendimiento.
      NOTA: guardar y cerrar cada imagen se ralentizará drásticamente el proceso manualmente. Consulte el manual del usuario del microscopio para obtener información sobre la disponibilidad de una función de incremento automático.
   2. Capturar al menos tres imágenes que no se solapan de la región central de la hemocitómetro Aunque se recomienda más (5-10) para aumentar la precisión.
      NOTA: Evitar tanto las zonas superior e inferior de las cámaras como las células tienden a aumentar la densidad en ambos lugares. Tome el mismo número de imágenes para cada cámara. Esto es necesario para el buen funcionamiento del plugin durante el recuento.

   5. Contar Imagen y diluciones

   1. En CCC, haga clic en "contar las células 'y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione una carpeta para ser contado.
   2. Observe el cuadro de entrada de número de la muestra después de seleccionar una carpeta. Introduce el número de imágenes tomadas por la cámara, es decir, 4.1.2, y haga clic en "Aceptar". El plug-in ahora contará todos los JPG, TIFF y PNG en la carpeta seleccionada en orden alfabético.
      NOTA: Al hacer clic en el botón "Visor de muestras de 'abrirá la ventana Visor de muestras de mostrar información sobre las muestras contadas. concentración de la muestra es la concentración promedio de todas las imágenes tomadas por la cámara. Las muestras con concentraciones sin unidades se pueden añadir a esta lista, como la adición de un medicamento o tratamiento molécula pequeña.
      1. Recuento de las muestras de células si las concentraciones varían de forma significativa en el recuento de las mismas muestras (sección 4).
         NOTA: Para el cálculo de diluciones para todo tcontaba-muestras, CCC utiliza automáticamente la fórmula C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
   3. Usa el escenario de la siembra de 15.000 células por 200 l en 30 pocillos de una placa de 96 pocillos + 1 extra:
      1. Establecer el cuadro de texto a la derecha de la etiqueta C2 a 15.000 y el volumen de texto concentración a 200, el cambio de la unidad de cuadro combinado junto a 'l'.
         NOTA: El plugin en última instancia, calcular la concentración en células / ml.
      2. Asegúrese de que el cuadro combinado volumen ha seleccionado V2 (volumen final) y en el cuadro de texto a la derecha entrar en 6200 (200 l x (30 + 1)), la selección de 'l' en el cuadro combinado unidad de volumen.
   4. Haga clic en "Calcular dilución" para añadir la dilución introducido en ese momento al cuadro de lista inferior izquierda.
      NOTA: Para cada dilución añadido, será resuelto por cada muestra y se muestra en el diagrama de árbol a la derecha. Haga doble clic en cada entrada se expanda.
   5. Al hacer clic en tél botón "Guardar" debajo del botón 'Visor de muestras de' escribir en el archivo todos los datos de la muestra y diluciones.
   6. NOTA: Estos datos se pueden recuperar en cualquier momento haciendo clic en "Load" y seleccionar el archivo guardado.

   6. migración y la invasión (Contador)

   1. Realizar los ensayos de migración e invasión utilizando el método de la cámara de Boyden estándar ^7-9.
   2. Después las células han emigrado / invadido, retirar con cuidado los medios de comunicación dentro de la inserción por inversión y golpeando suavemente. Wick de distancia de cualquier medio exceso adheridos a la parte inferior de la membrana por tocar el borde de una toalla de papel.
      NOTA: No toque la propia membrana a la toalla, esto puede desprender las células adheridas.
   3. Fijar y teñir las células como informó ^7-9 en una placa de 24 pocillos establecido con cada fila que contiene ~ 500 l de una solución diferente, por ejemplo, fijador, Tinte 1, 2 de la mancha, y agua doblemente destilada _(ddH2O). Llene una segunda placa con PBS 1x tO colocar los insertos en antes de cortar.
   4. Lavar los insertos colocándolos en pozos llenos de ddH ₂ O y llenar el inserto con ddH ₂ O. Escurrir el agua antes de hisopado distancia células por inversión.
   5. Use un aplicador de algodón limpio para eliminar las células-un emigrado / un-invadido desde la parte superior de la membrana con cuidado de no dañar la membrana. Sea cuidadoso alrededor de los bordes de la membrana.
   6. Cortar la membrana utilizando una navaja o un bisturí y cuidadosamente transferir la membrana (lado de abajo hacia arriba) en un portaobjetos de vidrio limpio.
   7. Añadir una pequeña gota de solución de montaje por debajo y en la parte superior de la membrana y cubrir con una hoja de cubierta delgada.
      NOTA: Evitar que queden atrapadas burbujas dentro de la solución de montaje para preservar la exactitud de los recuentos.

   7. La disección de Alcance y Configuración de la cámara

   1. Encienda la fuente de luz del microscopio y la cámara.
      NOTA: Consulte el manual de usuario del microscopio para obtener instrucciones detalladas.
   2. Ingeniohin de software, configuración de captura de imágenes del microscopio establecidos a los valores por defecto.
      NOTA: Si existe una función de promedio, se recomienda un valor de cuatro. Este es un buen compromiso entre el grado de promediado y de adquisición de imágenes tiempo. Del mismo modo, un pequeño grado de afilado puede aumentar la fidelidad de la imagen.
      1. Set 'brillo', 'contraste', y 'saturación' al 100% y 'gamma' y 'ganancia' a 1,0.
         NOTA: En función del software, 'brillo' y el 'contraste' pueden por defecto a un valor de 0% en lugar del 100%.
      2. Ajuste pantalla (en tiempo real) y la resolución de captura a sus valores máximos (1.600 x 1.200 píxeles y 2.592 x 1.944 píxeles, respectivamente).
         NOTA: Resolución de la pantalla se puede ajustar según sea necesario, si la frecuencia de actualización es demasiado lento. Las resoluciones más bajas harán que sea más difícil de enfocar con precisión, pero aumentará la frecuencia de actualización.
   3. Para la etapa del alcance de disección, utilice un sólido blanco background; un fondo negro o vidrio es insuficiente.
   4. Utilice la fuente de luz de la etapa anterior, preferiblemente de dos luces LED flexibles a la derecha ya la izquierda del escenario.
      NOTA: A continuación etapa fuente de luz se iluminará los poros dentro de la membrana de ensayo de migración que puede influir negativamente en la precisión de los recuentos posteriores.
   5. Colocar un portaobjetos de membrana de ensayo de migración completado en el escenario. Mirando la imagen en tiempo real mostrado por el software en, ajustar la ampliación con la perilla de ajuste de zoom de modo que los bordes de una sola membrana son sólo dentro del campo de visión de la cámara.
      NOTA: Colocar el portaobjetos en una placa de vidrio overtop el fondo del escenario blanco hace que sea más fácil de maniobrar la corredera para la imagen.
   6. Ajustar las posiciones de luz de origen (7.6.1) y tiempos de exposición para reproducir lo más estrechamente posible la imagen ideal representada en la Figura 2A. Dependiendo de la luminosidad, los tiempos de exposición de 5-60 ms deberían ser suficientes.
      NOTA:El objetivo es producir una imagen con tan poco color de fondo como sea posible y una membrana uniformemente iluminado sin reducir la fidelidad de la imagen, es decir, la exposición excesiva que conduce a una pérdida de células visibles.
      1. Coloque las fuentes de luz de izquierda y derecha en un ángulo bajo en relación a la diapositiva. Esto ayudará a eliminar las manchas de fondo y las aberraciones cromáticas. Trate de mantener cada fuente de luz directamente opuesta a la otra.
         NOTA: Si bien la maniobra cada fuente de luz en la posición, poner la otra fuera. Esto ayuda a centrar el área de la iluminación sobre la membrana en sí más fácilmente y con precisión.
   7. Retire la corredera y el balance de blancos de la imagen usando un solo clic de botón en el software del microscopio.
      NOTA: El microscopio está calibrada. Guardar tantas configuraciones como sea posible para su uso futuro y tomar nota de las posiciones de la fuente de luz y la intensidad.

   8. Adquisición de imágenes y Flatfield

   1. Dentro del software, configurarla ubicación de la carpeta de captura y captura de una imagen por membrana. Nombre las imágenes siguiendo el modelo general de: Nombre - ###, por ejemplo, control - 001.tif, control - 002.tif, Fármaco de ensayo - 001.tif, y así sucesivamente.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados de imagen, guardar el tipo de archivo de imagen como TIFF con respecto a otros formatos con pérdida, como JPEG.
      NOTA: Las imágenes no siguen el modelo general se seguirán contando, pero no estarán sujetos a la agrupación automatizada y fildeo plana.
      1. Si se desea corrección flatfield, para cada diapositiva encontrar un área vacía y tomar una imagen en blanco después de la convención de nombres: Nombre - en blanco.
         NOTA: Un espacio en blanco es un área en la diapositiva que contiene la membrana y representa la iluminación de fondo.
      2. Inmediatamente antes de la proyección de imagen, aplanar cada membrana mediante la aplicación de presión sobre el cubreobjetos y eliminar tantas burbujas atrapadas como sea posible.
   2. En ImageJ, ir a Plugins y abrir el plugin TC; por ejemplo, los plugins> Análisis> & #39, Transwell Contador '.
   3. Dentro de TC, haga clic en el botón 'Flatfield' y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la carpeta donde se guardan las imágenes de membrana.
      NOTA: Sólo las imágenes guardadas con la plantilla general anterior será automáticamente flatfield corrige y graba en una nueva carpeta llamada Flatfield dentro de la carpeta elegida. Véase la Figura 2B para un ejemplo de una imagen flatfield corregido.

   9. Valores de configuración

   1. Abra una imagen de membrana de ensayo de migración en ImageJ ( "Archivo"> ​​"Abrir") y seleccione Imagen> Ajustar> 'Umbral de color ...'. Observe la ventana Umbral de color para ajustar los colores que se filtra fuera de la imagen.
      1. En la parte inferior de la ventana, establezca el método de umbral para 'Shanbhag', color Umbral de 'White', y el espacio de color a "RGB" (rojo azul verde); Fondo oscuro desmarque de ser seleccionado.
      2. Ajustar la parte superiordeslizadores haciendo clic y arrastrando los marcadores a 0 y los deslizadores inferiores a 255 (dejan los deslizadores inferiores a 255). Asegúrese de que la imagen es completamente blanca.
   2. Ajuste los deslizadores top verde y rojo hasta que sólo los núcleos son visibles.
      NOTA: Los ajustes seleccionados variarán por completo de la mancha celular utilizada. Véase la figura 2C.
   3. En el plugin de TC, los valores de entrada de los mejores deslizadores RGB en los cuadros de texto 'RGB umbral "los ajustes de configuración asociados. Haga clic en el botón "Añadir / Modificar 'y sobrescribir la configuración.
      1. Deja el tamaño del rango inferior y superior en los valores 1 - Infinity.
   4. En el panel Ajustes de configuración, haga clic en "Guardar" para escribir la configuración en el disco duro.

   10. Contar las imágenes y calibración

   1. Abra el complemento de TC (8,2) y haga clic en "Count carpeta 'y observar el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la carpeta que se contaba unand esperar a que termine.
   2. Cada muestra de contado-se añade automáticamente a la tabla principal. columnas clave son 'conde', 'calidad', y 'Calibre?'.
      NOTA: El conde no calibrado es el número de partículas por membrana dentro del área que se muestra en la columna «rango de la zona '.
      NOTA: La calidad varía de aproximadamente -0,8 a 1,7; Q ≥ 0,5 es aceptable.
      1. Observar una marca de verificación en el 'Calibrar?' columna si una imagen se encuentra en posición de calibración en base a su parecido con las métricas ideales.
         NOTA: Tanto la calidad y calibración pueden sugerir que los valores actuales son posiblemente insuficiente. Si después adecuada 'color Umbral "y" tamaño oscila' han sido seleccionados y calibración todavía se sugiere, la inspección del original y se contaron las imágenes deben ser el determinante final de un conteo válido.
   3. Seleccionar todas las muestras en la Tabla Marcado para la calibración.
      1. Haz clic derecho en tél tabla y seleccione Recuento> 'El tamaño sugerido'. Esto vuelve a contar las imágenes con una superficie de partícula mínimo sugerido.
      2. Haga clic derecho de nuevo y seleccione "Mostrar gráfico". Observar el gráfico de dispersión de frecuencia de las áreas de partículas. Una imagen ideal tendrá un gráfico que se asemeja a una distribución a largo cola derecha normal, es decir, la curva de campana. Vea la Figura 3B.
      3. Ajustar el rango de tamaño inferior, si es necesario, mediante la selección de la muestra, hacer clic derecho y seleccionar Recuento> 'Los ajustes manuales. Observar el diálogo de configuración manual. Introduzca los ajustes deseados y haga clic en número de relatar la imagen con la nueva configuración.
   4. Para ajustar el recuento manual, seleccionar las muestras, haciendo clic derecho en la tabla y seleccione 'Abrir imagen con recuento'. Observar la imagen original con marcadores rojos que representan cada una de las partículas contadas por el plugin.
      NOTA: Recuento> 'Mostrar contó imagen binaria' puede ser útil para comprobar qué tan bien iNDIVIDUALES células están siendo resueltas por el umbral de color.
      1. Para agregar una cuenta, mantenga 'Ctrl' y click izquierdo. Observar un marcador en la posición del cursor, que se añadirá a las muestras de recuento total. Para eliminar un marcador, haga clic en la imagen. El plug-in se eliminará el marcador más cercano al cursor.
      2. Para eliminar un grupo de marcadores, utilice una herramienta de selección en ImageJ para seleccionar una región de interés (ROI). Mientras mantiene "Ctrl", haga clic derecho en la imagen y se eliminarán todos los marcadores dentro de la ROI. Observe el número de células en la columna 'conde'.

   11. Guardar / Abrir Resultados y exportar a CSV

   1. En TC, vaya a la barra de menús y haga clic en "Archivo"> ​​"Guardar como resultado '. Observe el cuadro de diálogo Guardar resultados. Elegir un nombre y un destino y haga clic en "Guardar".
      1. Use "Archivo"> ​​"Abrir los resultados 'para cargar un archivo que contiene todos los datos que se muestran en la tabla principal, including la trama.
         NOTA: El archivo de resultados guarda los directorios de las imágenes se guardan en Si las imágenes originales se mueven después de guardar, la "imagen abierta con recuentos '' Abrir imagen original 'y las funciones fallarán..
      2. Para restablecer el directorio de imágenes, seleccionar las muestras, haga clic derecho en la tabla y seleccione 'directorio de imágenes de Reset'. Observe el cuadro de diálogo Elegir directorio. Seleccione la nueva carpeta y si existen las imágenes, los directorios se reiniciarán. Vuelva a guardar el archivo de resultados.
   2. Para guardar un archivo de valores separados por comas (CSV), en la barra de menú vaya a "Archivo"> ​​"Exportar a .csv '. Esto produce un archivo con muestras organizadas en grupos estadísticos con la media del recuento y de error estándar de la media; su trazado se ha diseñado para la representación gráfica rápida en los programas de gráficos comunes.
      NOTA: Los grupos estadísticos se basan en los grupos creados dentro de TC.
      1. Si las muestras siguen el modelo general de nomenclatura, seleccionar las muestras para ser grouped, haga clic derecho y seleccione 'agrupación automática'. Esto agrega muestras con el mismo "nombre" a un mismo grupo. Usando el ejemplo de control - 1, control - 2, Tratamiento - 1, Tratamiento - 2: ambos controles se agregan al grupo "Control" y los tratamientos de 'tratamiento'.
      2. Añadir muestras manualmente a los grupos haciendo doble clic celular y escribiendo de la muestra "Grupo" en el nombre del grupo. Seleccione las muestras que han de añadirse a este grupo, clic derecho y seleccionar "Añadir al grupo '.

Representative Results

Calculadora Concentración celular

La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula:

P-cuadrado de un hemocitómetro tiene un volumen de 100 nL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) y dada esta constante, el volumen total de la imagen se puede calcular después de convertir píxeles a milímetros. La figura 1C es una imagen ideal, con numerable de enfoque células presentan la iluminación de fase característica y no hay graduaciones fondo hemocitómetro. Por último, el gráfico de dispersión de Figure 1D muestra una alta correlación, manual frente a recuento automatizado de las células de 57 imágenes tomadas a través de varios experimentos y tipos de células incluyendo HTR8, ES-2, y Swan71. Es de destacar que el rango superior de concentración fue de ~ 5,6 x 10 ⁶ células / ml con un extremo inferior de ~ 2.3 x 10 ³ células / ml (≈ 5 células por imagen). Se sugiere que si los recuentos están por debajo de 10-15 células por imagen, la muestra debe ser suspendido en un volumen más pequeño para aumentar el poder estadístico.

Adquisición y Procesamiento de Imágenes para la Migración Ensayo Contador

Cientos de membranas ensayo de migración se obtuvieron imágenes lo largo de muchos experimentos, todos los cuales se sembraron con la línea celular humana trofoblasto HTR8, Swan71, o una línea celular de cáncer de ovario ES-2. De estas imágenes, múltiples fueron escogidos para representar una gama de categorías de muy pobre a excelente calidad basado en el brillo, la claridad y el color de stainecélulas D, y el grado de tinción de fondo y partículas no deseadas (ruido). El uso de estas imágenes, los valores de color RGB umbral por defecto (≈ 150, 120, 0) se determinaron (Figura 2C) y se utilizan como una línea de base en todos los desarrollos posteriores del algoritmo. El objetivo era maximizar el color relación entre núcleo de color total, es decir, la mayoría de los píxeles de colores debe estar dentro de los núcleos celulares. El panel superior de la Figura 2A representa el brillo de la imagen ideal, célula claridad núcleos y el color, y el ruido de fondo insignificante. El brillo de la imagen es importante para asegurarse de que existe una gran suficiente contraste entre las células y el fondo para producir una imagen binaria en blanco y negro.

Si no se cumple esta diferencia, las áreas grandes o impredecibles podrán ser contados por el ImageJ Analizar la función de las partículas; el mejor de los casos es un fondo totalmente blanco. En oposición, el panel inferior de Fifigura 2A tiene la tinción de fondo extrema y las células que son casi indistinguibles. Las membranas con este grado de coloración lo más probable es producir resultados poco fiables desde el contador de ensayo de migración.

En algunos casos, el aumento de brillo al nivel ideal puede afectar fidelidad de la imagen por la sobreexposición de la imagen. Del mismo modo, la alta exposición o el brillo pueden producir efectos sistémicos cromáticas con luz progresiva o irregular y regiones oscuras. Con la corrección flatfield, estos efectos pueden ser minimizados o eliminados por completo como se muestra en la Figura 2B (vs. superior panel inferior). Además, la corrección flatfield es una buena manera de igualar el brillo de las imágenes múltiples de membrana.

Calibración y Validación de la Migración de ensayo Contador

Para ayudar a los EE.UU.er en una mejor determinación de si las imágenes de membrana ensayo de migración cumplen los criterios requeridos para el recuento exacto, dos calificadores fueron diseñados, de la especie llamada imagen (Q), y calibración de recomendación (CR). Es importante destacar que ambos calificadores, como su nombre sugiere CR, son sólo recomendaciones y actuar como guías más que los jueces absolutos de la rendición de cada imagen. Tanto Q y CR se basan en las métricas del gráfico de dispersión de partículas frecuencia de área (10.3.2). Para simplificar, una métrica puede ser considerada como las diversas formas de la curva que componen la trama de frecuencia. La métrica deseada de un Q adecuada (≥0.5) se determinó por la distribución normal aproximada observada de tamaño de celda. Comúnmente, las células que son irresolubles unos de otros, sobre-manchada, o simplemente particularmente grande, desplazan la asimetría de una distribución normal de extremo derecho (Figura 3B). Como tal, esta es la métrica ideal de una imagen calibrada típico. Conla adición de ruido de fondo, esto normalmente conduce a un gran número de partículas en el rango de 1-5 área de píxeles (Figura 3A). Para el cálculo de las métricas de la trama, los datos se ajustan con diez Savitzky-Golay curvas suavizadas de diferentes grados polinómicas producidos por la Biblioteca de Java Científica del Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Java/). Esencialmente, esto crea múltiples puntos en la región aproximada de cada extremum. A través de una serie de mapas de racimo densidad de los mínimos y máximos locales, un cuadro general de las métricas de la trama puede calcularse como una lista ordenada, es decir, mínimo, máximo, mínimo / máximo solapamiento, ..., n ^º valor extremo. En pocas palabras, el grado en que adaptarse a las curvas suavizadas los datos de frecuencia determina la forma apretada los extremos son puntos. Cuanto mayor es la agrupación de la no superposición-extrema, la mayor Q se hace. En teoría, Q representa la claridad de la imagen completa basada en tque la distribución de tamaños de partículas diferentes.

Si el CR booleana es verdadera o no depende de la secuencia de extremos. De la Figura 3A, la lista ordenada sería mínimo, máximo, y una secuencia de extremos superpuestos sobre la base de las propiedades de la curva de Savitzky-Golay. Desde la Figura 3A representa una secuencia general de este banderas Extrema CR como verdaderos imagen sin calibrar,, lo que sugiere al usuario que la imagen puede necesitar calibración. En el futuro, se puede ver que a partir de la figura 3B, esta lista sería idéntica pero con la exclusión de la primera mínimo. De esta manera se determinaron los parámetros de las imágenes no calibradas y calibrado ideales. Las desviaciones de estas métricas generalmente marcar una imagen para la calibración y reducir Q ≤ 0, como es el caso con el alto fondo de membrana de ruido en la Figura 3C. La aplicación de estos calificativos a una selecciónde modesto a excelentes imágenes, con lo que respecta a brillo y el ruido de fondo, es evidente que los recuentos de imagen calibrada son significativamente más cerca de recuentos manuales que no calibrada (1,9% ± 0,3 vs. 21,7 ± 2,9%, respectivamente; Figura 3D, E). Dada la alta calidad general de las imágenes elegidas para el análisis (sin calibrar = 0,71 ± 0,04; media ± SE), se produjo un aumento modesto de esperar sólo en Q tras la calibración ( = 0,90 ± 0,04). Tomados en conjunto, Q sugiere el potencial global de rendición de una imagen mientras que CR es un fuerte indicador de si la calibración es correcta o no.

Las comparaciones de temporización Tanto Contador Concentración celular y la migración de ensayo Contador

La figura 4A compara el tiempo de calibración CCC entre el usuario 1 y 2. Como era de esperar, el Usuario 1 era considerablemente más rápido que el usuario 2, en conjunto, teniendo un promedio de aproximadamente cinco minutos para la calibración de la CCC. Con el fin de comparar el conteo de hemocitómetro manual y automatizado de las tasas, la tasa de conteo manual de uso de un contador-registrador se comparó con el tiempo que se tardó en tomar nueve imágenes de la cámara de hemocitómetro y se contó en CCC (Figura 4B). Una concentración celular típica de 1,15 x 10 ⁶ células / ml se utilizó para comparar los tiempos, lo que lleva a un promedio de aumento 1x en el rendimiento. Esta tasa variará dependiendo del número de células cargado en elhemocitómetro como el tiempo total necesario para capturar imágenes y procesarlos es independiente del número de células.

Por último, los tiempos que abarcan la adquisición de imágenes de las membranas, la cuantificación dentro de TC, y los ajustes manuales de estas imágenes se midió en la Figura 4C. En particular, las membranas 12 Migración de ensayo con bajo número de células (células totales = 10.571) y sustancial tinción de fondo y los desechos celulares fueron elegidos para facilitar el peor escenario que requeriría ajustes manuales en el número de células. Esto se refleja en el ajuste de la figura 4C columna (Adj) donde tomó un promedio de 13 minutos para eliminar los recuentos de células no deseadas y añadir perdidas. Para la comparación de recuento manual, las tasas de recuento de células óptimas se determinaron con contador de células; Se utilizaron imágenes de membrana de alta calidad con alta densidad celular (resultados no mostrados). Esto produjo una tasa máxima media entre el usuario 1 y 2 de 9,1 x 10 ³ células / h(~ 2,5 células / s). Usando estos números, las membranas de la Figura 4C se contaron 4.4x más rápido con TC de lo que sería de esperar en tasa manual de máxima. El ahorro de tiempo son directamente dependientes de número de células y la calidad de imagen, contando membranas de migración que requieren poco o ningún ajuste y una alta densidad celular (~ 7.000 células / membrana), TC genera recuentos de células 1,395x más rápido que la tasa manual de máxima.

Figura 1: Concentración de la calculadora de la célula. Micrografía de contraste (A) Fase de la plaza principal central del hemocitómetro tomada en un aumento de 40X total. La barra de escala representa 200 micras. (B) Una versión de la imagen recortada de (A) representa lo que la longitud a medir en el hemocitómetro. La columna de longitud de la ventana Resultados se puso de relieve para facilitar su identificación. barra amarilla= 1 mm. (C) Una micrografía ideal de un hemocitómetro que contiene células HTR8 después de microscopio y software de calibración a 40X ampliación total con una resolución de 1600 x 1200 píxeles. Barra de escala = 200 micras. (D) Un gráfico de dispersión comparando los recuentos manuales utilizando el plugin de ImageJ Contador celular en comparación con el recuento automatizado de las mismas imágenes que usa la calculadora concentración celular. n = 57 imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ensayo de Migración contador de imágenes representativas. (A) El panel superior es una octava parte de un total de membrana que representa una imagen ideal con el fondo mínimo; Barra de escala = 200 micras. lapanel inferior contiene una imagen con la tinción de fondo significativo que afecta gravemente a la exactitud de la cuenta automática; Barra de escala = 585 micras. (B) El panel superior representa una imagen oscura de buena calidad que produce conteos inexactos. El panel inferior es una versión contable de la misma imagen después de la corrección flatfield. Barras de escala = 593 m. (C) El panel superior representa una vista ampliada de una membrana típica. El panel inferior es la misma imagen seguido por el umbral de color ImageJ deseado (umbral RGB = 150, 120, 0) para eliminar el fondo intercelular y la mayoría del citoplasma visiblemente manchadas. Todas las imágenes fueron tomadas en 1.35x ampliación total con un microscopio de disección calibrada a una resolución de 2.592 x 1.944 píxeles de múltiples invasiones ensayo de migración de HTR8 teñidas con hematoxilina. Barras de escala = 100 m. Haga clic aquí para competirwa versión más grande de esta figura.

Figura 3: La calibración y validación del ensayo de migración c ounter. (A) Un ejemplo típico de una imagen sin calibrar de alta calidad. (B) La versión calibrada de (A) mediante la migración recuento de contador de ensayo> 'El tamaño sugerido'. (C) Un gráfico de frecuencia típica de una membrana de baja calidad de imagen con una significativa mancha de fondo u oscuridad total. (D) Un gráfico de dispersión comparando los recuentos manuales utilizando el plug-in de contador celular ImageJ y el contador de ensayo de migración de los recuentos automáticos. (E) Un gráfico de barras que muestra la diferencia porcentual promedio de calibrado frente a los recuentos automáticos calibrados. Los datos son media ± SE. P <0,0001, n = 30, t-test no pareado con corre de Welchcción. Las mismas imágenes se utilizaron para D y E. La calibración de ambos se hizo con el recuento> 'El tamaño sugerido' y recuento> '' Los ajustes manuales para refinar aún más el tamaño mínimo de contado y el umbral de color. No se requieren ajustes manuales de conteo se hicieron utilizando la "imagen abierta con recuentos 'función. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El tiempo del contador de concentración de células y la utilización de contador de ensayo de migración. (A) Comparación de las horas de calibración CCC (pasos 1 y 2) entre el usuario 1 (CCC / experto TC) y Usuario 2 (CCC / TC novatos). (B) tiempos de conteo de células manual se promediaron durante cinco ensayos y se expresaron en células contadas por min. Automatic recuentos se calcularon los tiempos promedio para capturar nueve imágenes de una cámara de hemocitómetro y se contaron con la CCC. La concentración celular utilizada fue ~ 1,15 x 10 ⁶ células / ml. Los datos son media ± SE. n = 5. (C) los tiempos de Transwell contador se compararon más de tres categorías: las de adquisición (Acq; los pasos 7 y 8), cuantificación (Qnt; 10.1-10.3.3 pasos usando los valores de configuración por defecto), y ajuste manual (Adj; steps 10.4 -1.4.2). Las membranas cuantificados tenían un alto grado de tinción de fondo y los residuos con el fin de hacer necesario un ajuste manual considerable para recuentos exactos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones

La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo de migración. Por tanto, es de suma importancia para seguir microscopio y protocolos de calibración de software asociados de la mejor manera posible. Esto incluye la limitación del ruido de fondo, lo que reduce las partículas no deseadas, la captura de imágenes brillantes y de manera uniforme en-foco, y guardar en formatos de archivo sin pérdidas como tiff. Por lo tanto, ambos plugins son susceptibles de producir resultados erróneos si no se cumplen estos requisitos. Está por lo tanto, siempre es buena idea recuentos de células dobles comprobación para determinar si coinciden con las expectativas visuales cuando en doubt. Si, efectivamente, los resultados no coinciden, se compara la imagen original con la imagen binaria puede ayudar a dilucidar la cuestión (10,4 nota). En algunos casos, las imágenes ensayo de migración más oscuros pueden contener grandes áreas que han sido contados debido a los valores de píxeles que caen dentro de los límites de umbral de color. En general, el uso de una imagen de flatfield eliminará la oscuridad y la aparición de manchas y prevenir los recuentos más deseados debido a irregularidades cromáticas.

Teniendo en cuenta estos posibles problemas y relativamente comunes, es importante seguir las directrices de integridad de la imagen estándar, como los propuestos por el Nature Publishing Group y otros ^13. Para mantener los recuentos consistentes, cualquier ajuste de una imagen debe aplicarse por igual a todos los demás. Esto incluye pero no se limita a contraste, saturación, brillo, ganancia, filtros, como promedio y la nitidez, y filtros de color. El ajuste de gamma debe evitarse ya que se aplica un cambio no lineal de color del píxel y por lo tanto puede afectar a cada imagen diferentely ^14. Cuando se aplica un tiempo de exposición común a las imágenes con pocas células (<1,000), esto puede conducir a la sobreexposición y la pérdida de fidelidad de imagen. A la inversa, una membrana con miles de células puede requerir mayores tiempos de exposición para evitar la subexposición. En consecuencia, es la mejor práctica para ajustar las imágenes lo menos posible y sólo cuando sea necesario, para mantener la más alta fidelidad de la imagen alcanzable.

una imagen de alta fidelidad, incluso con, verdaderos recuentos de partículas pueden ser muy sesgada por las partículas no deseadas. Cuando se utiliza la calculadora de concentración de células, si una muestra contiene cantidades significativas de residuos de células, específicamente de áreas similares a las de las células en suspensión, esto puede sesgar el resultado. En algunos casos, esto podría impedir el análisis automatizado si los escombros no puede ser minimizado. Del mismo modo, las membranas de ensayo de migración que contienen altos niveles de la tinción de fondo de color similar a tiñeron células o células no removidos de la parte trasera de la membrana, probablemente producir inPrecisión resultados. Estas partículas no deseadas normalmente pueden eliminarse de varias maneras: aumentando el brillo de la fuente o el tiempo de exposición de luz, modificando el umbral de color a ser más estrictos, o eliminado de forma manual a través de 'Abrir imagen con recuento' (10.4). Es importante señalar que este protocolo produce la calidad óptima de imagen requerida para CCC y TC para mantener la precisión. Sin embargo, el TC es capaz de contar de imágenes significativamente menor calidad, diferentes aumentos, o diferentes manchas de color, por lo general sólo requiere más tiempo dedicado a los ajustes manuales (10.4).

Durante la calibración de cualquier imagen membrana ensayo de migración es importante tener en cuenta la resolución de la imagen y el tamaño relativo de las células. Como se ha descrito anteriormente, Calidad de imagen (Q) y la recomendación de calibración (CR) dependen de las métricas de frecuencia parcela de superficie de las partículas. De las imágenes analizadas, cada célula ocupa en promedio 1 / 100.000 de laárea de la imagen total. Cuando el uso de imágenes de sólo millones de píxeles con una pequeña relación de tamaño de célula, la variación en el tamaño de la celda es también pequeña. Es decir, la varianza solamente puede variar desde 10 hasta 60 px. Pero a medida que el área de la celda a la proporción de área de la imagen se hace más grande, la distribución de los tamaños de célula aumenta, la reducción de la curtosis de el tamaño de celda de distribución normal por la disminución de la frecuencia de cualquier área dada. Esto a su vez puede hacer que el cálculo automático del área de la celda más difícil o imposible debido a que un área mínima definida no se puede determinar. Del mismo modo, esto también se aplica a las imágenes con pocos números de células en las que la frecuencia de los diferentes tamaños de células puede ser muy baja (<50). Como resultado, cuando el análisis de imágenes con diferentes resoluciones que las utilizadas en este estudio o diferentes distribuciones de tamaño de las células, puede ser necesaria la identificación manual del intervalo de tamaño de célula (10.3.3).

Importancia y direcciones futuras

El contador de plug-in de la célula ImageJ fue inicialmente RelEasándose en 2001 por el Dr. Kurt De Vos y ha servido como un elemento básico para el recuento celular manual para el día de hoy. Para continuar con la tendencia de las herramientas libremente disponibles para la comunidad biológica, la calculadora de concentración de células y el contador de ensayo de migración ofrecen el siguiente paso en herramientas gratuitas para ayudar a aumentar el rendimiento y la reproducibilidad inter-experimental de los ensayos de migración. El resultado final de los ensayos de migración es dependiente del número de células sembradas altamente. Ergo un recuento de células fiable es una necesidad para la reproducibilidad. De este modo, CCC ofrece tanto una mayor precisión debido a una mayor certeza estadística de la concentración celular y la reducción de los tiempos de recuento de preservar la salud celular.

Por otra parte, el resultado final de ambos plugins es un recuento del número de células y no un índice relativo tal como fluorescencia. Varios otros protocolos existen medida que la fluorescencia después de la tinción, pero estos métodos adolecen de falta de sensibilidad ^13. Photoshop de Adobe ofrece su propio análisis de partículas tool pero el programa debe ser comprado para su uso y no ofrece el análisis post-conteo disponible de la migración contador de ensayo de ^20. Ambos plugins se basan en la función de recuento de partículas de ImageJ y en consecuencia pueden ser modificados por el usuario final mediante la edición de las macros utilizadas por ImageJ. Esto ofrece una mayor flexibilidad para el usuario para ampliar el alcance de los plugins a otras partículas mediante la creación de nuevas macros. Un mayor desarrollo para aumentar la amplitud de partículas contables e incorporar las contribuciones del usuario final es el siguiente paso lógico. Mediante la combinación de los principios básicos del contador de células con un análisis automatizado algoritmo de conteo y post-escrutinio, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración se pueden procesar sin ninguna pérdida de precisión. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required