Abstract
健康のImageJの国立研究所は、強力な、自由利用可能な画像処理ソフトウェアスイートです。 ImageJのは、様々な生物学的粒子をカウントするために有効に利用することができる総合的な粒子解析アルゴリズムを有します。セルの多数のサンプルをカウントすると、血球計数器は、時間に関してボトルネックを提示します。同様に、ImageJのプラグインセルカウンターで移行/浸潤アッセイからの膜を数え、正確なものの、非常に労働集約的主観、および手首の痛みを引き起こすための悪名高いです。このニーズに応えるために、我々は、自動血球計数器（または知られているボリューム）と移行/浸潤細胞計数の唯一のタスクのためのImageJ内の2つのプラグインを開発しました。どちらのプラグインは、最小限の背景に高品質の顕微鏡写真を取得する能力に依存します。彼らは、使いやすいとカウントのキャリブレーションを支援する組み込みの分析ツールを持つ大規模なサンプルサイズの迅速な計数および分析のために最適化されています。コア原理を組み合わせることにより自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析による細胞カウンタのsが、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。
Introduction
インビトロでの細胞計数では、組織培養実験の広い範囲の重要な基本的な技術です。正確に培養物中の細胞の数を決定する実験の再現性および標準化の1,2のために不可欠です。細胞計数は、血球計を用いて、ならびに自動化された方法の様々な独自の利点と欠点3,4,5でそれぞれを使用して手動で行うことができます。細胞計数のための自動化された方法のほとんどは、2つのクラス、コールター原理を使用するか、フローサイトメトリーもののいずれかに属しています。コールターカウンターは、細胞数およびサイズを決定するために、セルの電気抵抗を利用します。彼らは、高速で正確かつフローサイトメーターよりも安くなっています。しかし、彼らはほとんどマニュアルカウント3に比べて、それらのかなりのコストにのみ細胞計数のために使用されていません。フローサイトメーターは、一方で、高価であるが、それらは、細胞計数、細胞形状の解析、STのような多くの用途を有しますructureと内部細胞マーカーに4,5を測定します 。これら2つの原則のいずれかを使用するマシンは、多くのメーカーから入手可能です。自動化された方法は、手動計数のために必要な時間の一部が付属していますが、高価なマシン6を使用しながら手動カウントが手頃な価格が、時間がかかり、バイアスの対象となります。
他の一般的な細胞培養手順は、細胞遊走および浸潤7、すなわち、 インビトロ細胞運動性アッセイです 。遊走および浸潤アッセイは、一般的走化性応答に応答して細胞運動性および侵襲性を調査するために使用されます。さらに、それらは、広く多様な細胞型7-11の胚発生、分化、炎症反応、および転移を研究するために使用されます。遊走アッセイの多孔質膜を通って遊走または浸潤した細胞は、2つの異なる方法で定量することができます。あちこちまず、蛍光色素で細胞を染色することにより、解離蛍光リーダ12を用いて膜、および定量化をメートル。定量化のこの方法の制限は、レコードが膜を保持することができない、さらなる分析13のための可能性がないということです。第二の定量法は、クリスタルバイオレット、トルイジンブルー染料またはヘマトキシリンなどの細胞学的染料で、より一般的に蛍光色素またはで固定し、染色する浸潤/遊走した細胞のためのものです。次いで、細胞を、手動で、非常に時間のかかる作業12,13でこれらの膜を倒立顕微鏡画像を使用して定量します。
手動細胞計数の欠点を克服するために、細胞濃度および移動アッセイのための2つの信頼できる正確な自動細胞カウンターを開発しました。これらの自動化されたセルカウンタアルゴリズムは、OracleのJavaコンピュータ言語を使用してプラグインとしてImageJのために開発されました。 ImageJがょんの国立研究所によって開発された公開と広く使用されている画像処理ツールです。LTH（NIH）14,15;このように、ImageJのためにこれらのプラグインを書くこと生物群集への容易な統合を容易にします。
細胞計数の自動化は、手動カウントに比べて高いスループットと再現性を保証します。他の利用可能なソフトウェアやプラグインは、画像解析5,16,17、細胞濃度計算プラグインを介して細胞濃度を計算するために使用することができるが、高速であり、また、細胞および治療の希釈物を処理することができます。また、これら2つのカウンタからのすべての結果と計算が保存され、エクスポートすることができます。このホワイトペーパーで説明する2つのプラグインは、解剖スコープを使用することにより、生細胞イメージングおよび遊走アッセイ膜のための大きな視野（膜全体のキャプチャ）イメージング用の位相差顕微鏡の使用に最適化されています。 http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins：プラグインはからのインストール手順とダウンロードのために自由に利用できます。
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Protocol
1.複合顕微鏡とカメラ設定（細胞濃度計算）
- 、調光つまみで完全に電球の明るさを増やし4X対物レンズに切り替え、位相コントラストフィルタが選択されていることを確認します。
注：暗い背景と組織培養のための任意の倒立位相差顕微鏡、 例えば、PHPの位相差は、標準的な顕微鏡及びカメラ手順に従って使用することができます。 - 顕微鏡のソフトウェアの中では、デフォルト値に画像キャプチャ設定を行います。
注：これらの設定の場所を見つけるために、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。- 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
注：ソフトウェアによっては、「明るさ」と「コントラスト」は0パーセントの値の代わりに、100％をデフォルトにすることができます。 - セットの画像は黒と白のは、最高解像度のご利用できますを使用して捕捉されます電子（1600 X 1200ピクセル（px）以上）。
注：黒と白の設定が利用できない場合、0％の「飽和」は十分です。
- 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
- 顕微鏡ステージ上に標準血球計数器を配置し（ 図1A）に示されるように画像を取り込みます。これは、「ボリュームキャリブレーション画像」です。必要に応じて露光タイミングを調整します。
2.画像ボリュームキャリブレーション
- オープンImageJのとプラグイン]メニューから、細胞濃度の計算を開始（CCC）、プラグイン、 例えば 、プラグイン>アナライザ> '細胞濃度電卓」。
- 右側の「画像ボリュームキャリブレーション」パネルが表示されていない場合は、それを表示するには「キャリブレーション」をクリックします。
- ImageJのでは、「取得画像ディメンション」ボタンをステップ1.3（「ファイル」>「開く」）とCCCのクリックでから「ボリュームキャリブレーション画像」を開きます。
注：これは、両方の画像の幅を記入し、自動的にピクセル単位で画像の解像度を持つ高さテキストボックス。 - ImageJのでは、「直線ツール」の選択ツールの隣を選択し、血球計数器の一次（P）の全長に亘って直線を引くカーソルをクリックしてドラッグすることで（ 図1B）で実証-square。
- 直線寸法を含む結果]ウィンドウを表示するには、「M」キーを押してください。 CCCの「P-平方長」テキストボックス（ 図1B）に長さの列の値を入力します。
- 画像ボリュームのテキストボックスに画像ボリュームを出力する「計算画像ボリューム」ボタンをクリックしてください。画像のボリュームが既に知られている場合、交互に、画像ボリュームのテキストボックスにnLのボリュームを入力します。
- 「保存」ボタンをクリックします。
注：このプラグインは現在、キャリブレーションされています。
3.カメラの露出キャリブレーション
- 以下のための以下の細胞収穫血球計数器のチャンバ内に血球計数器、負荷細胞の10μLを経由してカウントし、顕微鏡ステージ上に置きます。
- 血球計数器の背景線が消えるように、ステップ1.2から同じ設定を使用して、露光時間を調整します。
- 細胞の内部には、セルの中央断面ではなく、極内でフォーカスを示す、細胞膜よりも暗くなるようにフォーカスを調整します。
- さらに、細胞が露出オーバーにならないように露出を調整します （ 図1C）に示されたものに似ています。
注：わずかに見える血球計数器ラインが許容されます。精度と再現性を維持するために、これらの設定を保存するか、または記録することをお勧めします。
4.画像取得
- 各細胞試料について、血球計数器の両方のチャンバへの負荷10μLは、統計的推論のパワー2を増加させます。顕微鏡ステージ上に血球計数器を置きますイメージングのため。
注：各画像の解像度や倍率は「ボリュームキャリブレーション画像 'と同じでなければなりません。プラグインは、任意の選択したフォルダのすべての画像をカウントします。同じフォルダにまとめてカウントする画像を続けます。- ファイル名のオートインクリメント機能が利用可能な場合、それをオンにし、各画像は、スループットを向上させるために捕獲した後に表示されていないことを確認してください。
注：手動で各画像を保存して閉じるには、大幅に処理が遅くなります。自動インクリメント機能の可用性について、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。 - （5-10）以上であるが、血球計数器の中央領域の少なくとも3つの非重複画像をキャプチャ精度を高めることをお勧めします。
注：細胞が両方の場所での密度が増加する傾向があるとして、チャンバーの上部と下部の両方の領域を避けてください。すべての室のための画像の同じ数を取ります。これは、カウント中にプラグインが正しく機能するために必要とされます。
5.イメージカウントと希釈
- CCCでは、「セルのカウント」をクリックし、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。カウントするフォルダを選択します。
- フォルダを選択した後、検体番号入力ボックスを確認します。室ごとに撮影した画像、 すなわち、4.1.2の番号を入力し、「OK」をクリックします。プラグインは現在、アルファベット順で選択したフォルダ内のすべてのjpg、TIFF、およびPNG画像をカウントします。
注：「サンプル・ビューア」ボタンをクリックすると、カウントサンプルについての情報を表示するサンプル・ビューア・ウィンドウが表示されます。サンプル濃度は、チャンバごとに撮影したすべての画像の平均濃度です。単位のない濃度を有する試料は、薬物または小分子治療の追加として、このリストに追加することができます。- 濃度が同じ試料（セクション4）のカウント以内大きく変わる場合細胞サンプルを物語ります。
注：すべてのtについての希釈を計算するには彼は、カウント・サンプルを、CCCは、自動的に式C 1 V 1 = C 2 V 2を使用しています。
- 濃度が同じ試料（セクション4）のカウント以内大きく変わる場合細胞サンプルを物語ります。
- 余分な96ウェルプレート+ 1の30ウェルに播種の200μLあたり15,000細胞を、シナリオを使用します。
- 「μL」に隣接するコンボボックスユニットを変更し、200に15,000 C2ラベルの右側と濃度のボリュームテキストボックスにテキストボックスを設定します。
注：このプラグインは、最終的に細胞/ mLの濃度を算出します。 - ボリューム単位コンボボックスで「μL」を選択、6200（200μLのX（30 + 1））を入力し、ボリュームコンボボックスが選択されたV2（最終体積）を持っていることを確認し、右側のテキストボックスにしてください。
- 「μL」に隣接するコンボボックスユニットを変更し、200に15,000 C2ラベルの右側と濃度のボリュームテキストボックスにテキストボックスを設定します。
- 左下のリストボックスに、現在入力された希釈を追加するには、「計算希釈]をクリックします。
注：追加されたそれぞれの希釈について、各サンプルについて解決されると、右のツリー図に表示されました。各エントリをダブルクリックして展開します。 - トンをクリックします彼は、「サンプル・ビューア」ボタンの下の「保存」ボタンをクリックすると、すべてのサンプルデータおよび希釈液をファイルに書き込みます。
- 注：これらのデータは、「読み込み」をクリックし、保存したファイルを選択することによって、いつでも回収することができます。
6.遊走および浸潤（カウンター）
- 標準Boydenチャンバー法7-9を用いて、遊走および浸潤アッセイを行います。
- 細胞が侵入し/移行した後は、慎重に反転し、穏やかにタップすることで、インサート内のメディアを削除します。ウィック離れたペーパータオルに端をタッチすることにより、膜の底に付着した余分なメディア。
注：これは接着細胞を取り除くことがあり、タオルに膜自体には手を触れないでください。 - 別のソリューションの〜500μlの、 例えば 、定着剤、ステイン1、ステイン2、および二重蒸留水（のddH 2 O）を含む各行に設定し、24ウェルプレートに7-9報告されたように細胞を固定し、染色します。 1×PBSトンと第二のプレートを埋めますO切断する前にインサートを配置します。
- ddH 2 Oを充填したウェルにそれらを配置することにより、インサートを洗浄し、反転により細胞を離れて拭き取り前に水を排水のddH 2 Oでインサートを埋めます。
- 膜を損傷しないように注意しながら、膜の上から非侵入/非遊走した細胞を除去するために、清潔な綿棒を使用してください。膜のエッジの周り徹底すること。
- カミソリやメスを使用して膜をカットし、慎重にきれいなスライドガラス上に膜（ボトムサイドアップ）を転送。
- 下に、膜の上にマウントソリューションの小滴を追加し、薄いカバースリップでカバーしています。
注：カウントの精度を維持するためにマウントソリューション内の気泡をトラップすることは避けてください。
7.スコープとカメラのセットアップを解剖
- 顕微鏡の光源とカメラの電源をオンにします。
注：詳細な手順については、顕微鏡のユーザーズマニュアルを参照してください。 - ウィット顕微鏡のソフトウェアをホアヒン、デフォルト値に画像キャプチャ設定を行います。
注：平均化関数が存在する場合は、4の値を推奨します。これは、平均化し、画像取得時間の程度との間の良好な妥協です。同様に、鮮鋭度が小さい画像の忠実度を増加させることができます。- 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
注：ソフトウェアによっては、「明るさ」と「コントラスト」は0パーセントの値の代わりに、100％をデフォルトにすることができます。 - それらの最大値に設定表示（リアルタイム）とキャプチャ解像度（1600 X 1200 pxと2592 X 1944ピクセル、それぞれ）。
注：リフレッシュレートが遅すぎる場合は、必要に応じてディスプレイの解像度を調整することができます。低解像度は、それがより困難に正確に焦点を合わせたものですが、リフレッシュレートを増加させることになります。
- 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
- 解剖スコープのステージのために、白色固体backgroを使用ウント;黒またはガラス背景が不十分です。
- 右に2つの可撓性のLEDライトから好ましくは、上記段の光源を使用して、ステージを去りました。
注：A下の段の光源は、負その後のカウントの精度に影響を与える可能性遊走アッセイ膜内の細孔を点灯します。 - ステージ上に完成した遊走アッセイ膜のスライドを置きます。単一の膜のエッジがちょうどカメラの視野内にあるように、ソフトウェアによって表示されるリアルタイム画像を見ると、ズーム調整つまみで倍率を調整します。
注：ガラス板上にスライドを配置オーバートップ白地ステージは、簡単に画像化のためのスライドを操縦することができます。 - できるだけ密接に図2Aに示された理想的な画像を再現するために、光源の位置（7.6.1）と露光時間を調整します。明るさに応じて、5から60ミリ秒の露光時間は十分であるべきです。
注意：目的は、目に見える細胞の喪失につながる可能な限り少ない背景色と、すなわち画像の忠実度を低下させることなく均一に照明膜、露出オーバーの画像を生成することです。- スライドに低い角度で左右の光源を配置します。これは、地汚れや色収差を除去するのに役立ちます。他に直接反対の各光源を保つようにしてください。
注：所定の位置に各光源を操作しながら、他の電源をオフにします。これは、より簡単かつ正確に膜自体の上に照明の領域を中心に役立ちます。
- スライドに低い角度で左右の光源を配置します。これは、地汚れや色収差を除去するのに役立ちます。他に直接反対の各光源を保つようにしてください。
- スライドとホワイトバランス顕微鏡ソフトウェアの単一のボタンのクリックを使用して画像を削除します。
注：顕微鏡は今較正されます。将来の使用のために、できるだけ多くの設定を保存して、光源の位置と強度のメモを取ります。
8.画像取得とフラットフィールド
- ソフトウェアの中で、設定キャプチャフォルダの場所、および膜ごとに1つの画像をキャプチャします。ように001.tif、および- ###、 例えば 、コントロール- - 001.tif、コントロール- 002.tif、試験薬剤名：の一般的なテンプレート以下の画像に名前を付けます。
注：最高の画像結果を得るには、JPEGなどの他の非可逆フォーマットを超えるTIFFなどの画像ファイルの種類を保存します。
注：画像はまだカウントされる一般的なテンプレートを以下ませんが、自動化されたグループ化とフラットフィールディングの対象にはなりません。- フラットフィールド補正を希望する場合は、各スライドの空の領域を見つけて、命名規則次の空白の画像を撮る：名前 - ブランク。
注：ブランクは全く膜を含まず、背景照明を表し、スライド上の領域です。 - すぐに撮影する前に、カバーガラスの上に圧力を適用することにより、各膜を平坦化し、可能な限り多く捕獲された気泡を除去。
- フラットフィールド補正を希望する場合は、各スライドの空の領域を見つけて、命名規則次の空白の画像を撮る：名前 - ブランク。
- ImageJのでは、プラグインに移動し、TCプラグインを開きます。 例えば、プラグイン>分析>＆＃39;トランスウェルカウンター」。
- TCの中で、「フラットフィールド」ボタンをクリックして、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。膜の画像が保存されたフォルダを選択します。
注：上記の一般的なテンプレートに保存されたイメージのみが自動的に補正され、選択したフォルダ内のフラットフィールドと呼ばれる新しいフォルダに保存フラットフィールドされます。フラットフィールド補正画像の例については、 図2Bを参照してください。
9.構成の設定
- ImageJの（「ファイル」>「開く」）に移動アッセイ膜の画像を開き、イメージを選択>>調整「色のしきい値を...」。画像からフィルタリングされるかを色調整する色Threshold]ウィンドウを確認します。
- ウィンドウの下部に、「RGB」（赤、緑、青）に設定しきい値処理法」Shanbhag」に、「ホワイト」にしきい値の色、および色空間で、選択された場合は暗い背景をオフにします。
- トップを調整します0〜255までのマーカーと下部のスライダーをクリックしてドラッグすることにより、スライダは（255で下部のスライダーを残します）。画像が完全に白であることを確認してください。
- 核のみが表示されるまで、緑と赤の上部のスライダーを調整します。
注：選択した設定が使用される細胞染色に完全に変化します。 図2Cを参照してください。 - TCプラグインでは、関連する構成の設定」のRGBしきい値」テキストボックスに入力されたRGBトップスライダーの値を。 「追加/変更」ボタンをクリックし、設定を上書きします。
- 1でサイズレンジ下限と上限の値のままにしておきます - インフィニティ。
- コンフィギュレーション設定]パネル内では、ハードドライブに設定を書き込むために[保存]をクリックします。
10カウント画像とキャリブレーション
- TCプラグイン（8.2）を開き、「フォルダをカウント」をクリックし、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。 Aをカウントするフォルダを選択それが終了するのND待ちます。
- 各カウント・サンプルが自動的にメインテーブルに追加されます。キー列は「カウント」、「品質」、および「キャリブレーション？」です。
注：未校正さCountは列 'エリアの範囲」に表示された領域内膜当たりの粒子数です。
注：品質は約-0.8〜1.7の範囲です。 Q≥0.5は許容可能です。- チェックマークを守って「キャリブレーション？」列の画像は、理想的なメトリックに似ていることに基づいて、キャリブレーションのためのフラグが設定されている場合。
注：品質とキャリブレーションの両方が現在の設定はおそらく不十分であることを示唆しているかもしれません。適切な「カラー閾値化」と「サイズが範囲 'の後に選択されており、キャリブレーションはまだ、元の検査を提案し、イメージが有効な数の最終的な決定要因であるべきでカウントされた場合。
- チェックマークを守って「キャリブレーション？」列の画像は、理想的なメトリックに似ていることに基づいて、キャリブレーションのためのフラグが設定されている場合。
- キャリブレーションのためのフラグ付き表内のすべてのサンプルを選択します。
- トンで右クリック彼はテーブルを選択し再集計> '推奨サイズ」。これは、提案した最小粒子面積で画像を再集計します。
- もう一度右クリックして、「プロットの表示」を選択します。粒子領域の周波数散布図を確認します。理想的なイメージは、すなわち 、ベル曲線を長い右尾の正規分布に似たグラフを持つことになります。 図3Bを参照してください。
- サンプル、右クリックを選択し、再集計> '手動設定」を選択することで、必要に応じて、より低いサイズ範囲を調整します。手動設定ダイアログを確認します。必要な設定を入力し、新しい設定で画像を再集計するカウント]をクリックします。
- 、手動でカウントを調整したサンプルを選択し、右の表をクリックし、「カウントを持つ画像を開く」を選択します。プラグインによってカウント各粒子を表す赤いマーカーを有する元の画像を観察します。
注：再集計> '表示するバイナリイメージを数え「どれだけ私チェックすると便利ですndividual細胞は色のしきい値によって解決されています。- カウントを追加するには、「Ctrlキー」と左クリックを押したままにします。サンプル総数に追加されるカーソル位置にマーカーを確認します。マーカーを削除するには、右の画像をクリックします。プラグインは、カーソルに最も近いマーカーを削除します。
- マーカーのグループを削除するには、関心領域（ROI）を選択するためのImageJの中の選択ツールを使用します。 「Ctrlキー」を押しながら、右の画像をクリックして、ROI内のすべてのマーカーが削除されます。 「カウント」列のセル数を確認します。
11.保存/結果を開き、CSVへのエクスポート
- TCでは、メニューバーに移動し、「ファイル」>「保存結果」をクリックします。結果の保存]ダイアログボックスを確認します。名前と保存先を選択し、[保存]をクリックします。
- 「ファイル」を使用してください>メインテーブルに表示されているすべてのデータを含むファイルをロードするための「オープン結果」、includinグラムプロット。
注：結果ファイルには、画像が保存されるディレクトリを保存し、元の画像が失敗し、関数のカウントを持つ画像を開く」、「オリジナルを開く画像 'とを保存した後に移動している場合。 - 、画像ディレクトリをリセットするサンプルを選択するには、右側のテーブルをクリックし、「イメージディレクトリをリセット」を選択します。ディレクトリの選択]ダイアログボックスを確認します。新しいフォルダを選択して、画像が存在する場合、ディレクトリがリセットされます。結果ファイルを再保存します。
- 「ファイル」を使用してください>メインテーブルに表示されているすべてのデータを含むファイルをロードするための「オープン結果」、includinグラムプロット。
- カンマ区切り（CSV）ファイルを保存するには、メニューバーの「ファイル」>「.csvファイルにエクスポートする」を参照してください。これは、平均数と平均の標準誤差で統計的なグループに編成サンプルを使用してファイルを生成します。そのレイアウトは一般的なグラフ作成プログラムで迅速なグラフ作成のために設計されています。
注：統計グループはTC内で作成されたグループに基づいています。- サンプルは、一般的な命名テンプレートに従っている場合、サンプルはグラムであることを選択しますouped、右クリックして、「自動グループ化」を選択します。これは、同じグループに同じ「名前」でサンプルを追加します。両方のコントロールが「治療」にグループ「コントロール」および治療に追加されます：1、コントロール - - 2、トリートメント - - 1、処理2例のコントロールを使用しました。
- グループ名には、サンプルの「グループ」のセルとタイピングダブルクリックして、グループに手動でサンプルを追加します。このグループに追加するサンプルを選択し、右クリックし、[プロパティ]を選択 'グループに追加]。
- ファイル名のオートインクリメント機能が利用可能な場合、それをオンにし、各画像は、スループットを向上させるために捕獲した後に表示されていないことを確認してください。
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Representative Results
細胞濃度の計算
図1は、CCCのキャリブレーションと可算画像取得の全体的なプロセスを提示しています。 図1Aおよび1Bは 、ピクセル単位でP-正方形の長さのP-正方形のキャリブレーション画像や計算を示しています。 CCCは、式を使用して、指定されたボリューム内の細胞濃度を決定します。
血球計数器のP-四角は100 nLの（X 0.1ミリメートル1ミリメートル×1ミリメートル）の容積を有しており、この一定の与えられた、総画像ボリュームはミリメートルにピクセルを変換した後に計算することができます。 図1Cは 、合焦細胞位相特性の照明と背景なしの血球計数器の目盛りを表示する理想的な可算イメージです。最後に、Figurの散布図電子1DはHTR8、ES-2、およびSwan71含む様々な実験や細胞型を引き継いで57の画像から細胞の自動カウント対相関の高い、マニュアルを示しています。注目すべきは、濃度の上限範囲は、〜2.3×10 3細胞/ mLの（画像あたり≈5細胞）のローエンドで〜5.6×10 6細胞/ mLでした。カウントが画像あたり10~15細胞未満である場合、サンプルは、統計的検出力を増加させるために小さな体積中に懸濁されるべきであることが示唆されています。
移動アッセイカウンター用画像の収集と処理
遊走アッセイ膜の数百は、ヒト栄養膜細胞株HTR8、Swan71、または卵巣癌細胞株ES-2を播種したすべてが多くの実験を介して画像化しました。これらの画像のうち、複数の明るさ、明快さとstaineの色に基づいて優れた品質に非常に悪いからカテゴリの範囲を表すために選択されましたD細胞、及びバックグラウンド染色および不要な粒子（ノイズ）の程度。これらの画像は、デフォルトのRGBしきい値のカラー設定（≈150、120、0）（ 図2C）を決定し、アルゴリズムのすべての後続の開発のベースラインとして使用されたを使用しました。目標は、 すなわち、着色画素の大部分は細胞核内にあるべきで、総色比に核の色を最大化することでした。 図2Aの上のパネルは、理想的な画像の明るさ、細胞核の透明度及び色、無視できる背景雑音を示します。画像の明るさは、白黒2値画像を生成する細胞と背景との間に大きな十分なコントラストがあることを確認することが重要です。
この違いが満たされない場合、大きいまたは予測不可能な領域が粒子の機能を分析するのImageJによって計数することができます。最良のシナリオは完全に白色の背景です。 Fiのの反対で、下部パネルグレ2Aは、極端なバックグラウンド染色とほぼ区別できないセルを有します。染色のこの度を有する膜は、最も可能性の高い移動アッセイカウンタから信頼できない結果を生成します。
いくつかの例では、理想的なレベルに輝度を増加させると画像をoverexposingて画像忠実度に影響を及ぼし得ます。同様に、高露出や明るさが漸進的または不規則な明るい領域と暗い領域と全身色彩効果を生み出すことができます。フラットフィールド補正と、これらの影響を最小限に抑えるか、図2B（上側対下のパネル）に示すように完全に除去することができます。また、フラットフィールド補正は、複数の膜の画像の明るさを均一化するための良い方法です。
移動アッセイカウンターの校正・検証
私たちを支援するために、遊走アッセイ膜の画像は、正確な計数のために必要な基準を満たしている場合、ERより良い決定では、2つの修飾子は、設計された画像品質（Q）と呼ばれ、キャリブレーション勧告（CR）。重要なことは、両方の修飾子は、名前のCRが示唆するように、むしろ各画像の可算の絶対的な判断よりもガイドとしてのみお薦めや行為があります。 QおよびCRの両方が粒子面積（10.3.2）の周波数散布図の評価指標に基づいています。簡略化のため、メトリックは、周波数プロットを構成する曲線の様々な形状とみなすことができます。適切なQ（≥0.5）の所望のメトリックは、セルサイズの観察近似正規分布によって決定しました。一般的に、過染色し、互いに解決不能である細胞、またはちょうど特に大きなは、右尾の正規分布（ 図3B）にskewednessをシフトします。このように、これは、典型的な較正画像の理想的な測定基準です。とともにバックグラウンドノイズの付加は、これは通常1-5画素エリアの範囲（ 図3A）中の粒子の多くをもたらします。プロットの指標を計算するために、データは、博士マイケル・トーマス・フラナガンのJava科学図書館（http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanagaによって生成多項式度の異なる10のSavitzky-Golayの平滑化曲線が付いています/ javaの/）。基本的に、これは各極値のおおよその地域内の複数のポイントを作成します。極小及び極大の密度クラスタマップの一連のプロットメトリックの一般的な画像は、順序付きリスト、すなわち、最小値、最大値、最小値/最大重なり、...、N 番目の極値として計算することができます。簡単に説明すると、平滑化曲線は周波数データをフィットする度合いが極値点をされているパックされた方法をしっかりと判断します。非重複極値のクラスタリング大きく、大きくQとなります。理論的には、Qは、トンに基づいて、全体的な画像の鮮明さを表し明確な粒子サイズの彼が分布。
ブールCRが真であるかどうかは極値の配列に依存します。 図3Aから、順序付けられたリストは、最小値、最大値、およびサビツキー・ゴーレイ曲線の特性に基づいて、重複極値のシーケンスになります。 図3Aは、画像が、キャリブレーションが必要な場合があり、ユーザーに示唆、キャリブレーションされていない画像、真極値フラグCRのこの一般的なシーケンスを表しているので。今後、 図3Bから、このリストは同一であるが、第1の最小の排除であろうことが分かります。したがって、理想的なキャリブレーションされていないと較正された画像のメトリックを決定しました。これらの指標からの逸脱は、一般的にキャリブレーション用の画像をフラグと、 図3Cの高いバックグラウンドノイズ膜の場合のように、Q≤0を、減少します。選択にこれらの修飾子を適用します優れた画像へのささやかなの、明るさとバックグラウンドノイズに関しては、較正済み画像の数が較正されていないよりも、手動カウントにかなり近づいていることは明らかである（それぞれ、0.3対21.7％±2.9、±1.9％; 図3D、E）。分析のために選択した画像の全体的な高品質（未較正を考えます
= 0.71±0.04; ）平均±SE、あったキャリブレーション後のみQで期待適度な増加（ = 0.90±0.04）。 CRは、キャリブレーションが成功したか否かの強力な指標であるのに対し、一緒になって、Qは、画像の全体的な可算可能性を示唆しています。
細胞濃度カウンターと移動アッセイカウンタの両方のタイミング比較
図4Aは、予想されたように、ユーザ1と2の間CCCキャリブレーション時間を比較し、ユーザー1は、CCCのキャリブレーションのための平均は約5分で取って、一緒に、実質的に速いユーザー2を超えました。手動の血球計数器の計数および自動化率を比較するためには、数取器を使用してカウントを手動率は、血球計数器室の9画像を撮影するのにかかった時間と比較して、CCC（ 図4B）で計数しました。 1.15×10 6細胞/ mLの典型的な細胞濃度は、スループットの1X増加の平均値につながるタイミングを比較するために使用されました。この速度は、にロードされたセルの数に応じて変化します画像をキャプチャし、それらを処理するのに要した合計時間など血球計で細胞数とは無関係です。
最後に、膜を、TC内の定量化、およびこれらの画像の手動調整の画像取得を包含するタイミングは、図4（c）で測定しました。注目すべきことに、低い細胞数（=合計10571細胞）および実質的なバックグラウンド染色および細胞残屑12遊走アッセイ膜は、細胞数に手動調整が必要になる最悪のケースのシナリオを容易にするように選択しました。これは、それが不要なカウントを削除し、逃したセルを追加するために13分の平均をとった図4C調整 （ADJ）欄に反映されます。手動カウントとの比較のために、最適な細胞の計数率は、セルカウンターを用いて測定しました。高い細胞密度を有する高品質の膜の画像を使用した（結果は示さず）。これは、9.1×10 3細胞/ hのユーザー1と2の間の平均最大速度が得られました（〜2.5細胞/秒）。これらの番号を使用して、 図4（c）からの膜は、より高速なTCと最大手動速度で予想されるよりも4.4倍を数えました。時間の節約は、ほとんどまたは全く調整し、高細胞密度（〜7,000細胞/膜）が必要移行膜をカウントすることにより、細胞数と画質に直接依存している、TCは、細胞数が速く最大手動速度より1,395x生成しました。
図1： 細胞濃度の計算。 （A）40X合計倍率で撮影し、血球計数器の中央主要な正方形の位相差顕微鏡写真。スケールバーは200μmで表します。 （B）Aは、血球計数器で測定するためにどのような長さの描写（A）からのイメージのバージョンをクロップ。結果ウィンドウの長さの列が簡単に識別するための強調されました。黄色のバー= 1ミリメートル。 （C）1600 X 1200ピクセルの解像度で40倍の総合倍率の顕微鏡とソフトウェアキャリブレーション後HTR8細胞を含む血球計数器の理想的な顕微鏡写真。スケールバー=200μmです。 （D）細胞濃度の電卓を使用して、同じ画像の自動カウントに比べImageJのプラグインセルカウンターを使用して手動でカウントを比較する散布図。 n = 57の画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 移行アッセイ は 、 代表的な画像に対抗します。 （A）上のパネルは、最小限の背景理想的な画像を示す全膜8分の1部分です。スケールバー=200μmです。ザ下のパネルは、深刻な自動計数の精度に影響を与える重要なバックグラウンド染色と画像が含まれています。スケールバー= 585μmで。 （B）上のパネルは、不正確な数を生成し、良質の暗いイメージを表します。下のパネルは、フラットフィールド補正後の同じ画像の可算バージョンです。スケールバーは593ミクロンを=。 （C）上のパネルは、典型的な膜のズームインビューを表します。下のパネルは、細胞間の背景と目に見えて染色された細胞質の大部分を除去することが望まImageJのカラーしきい値（RGBしきい値= 150、120、0）に続いて同じ画像です。すべての画像はヘマトキシリンで染色したHTR8の複数の移動アッセイの侵略から2592 X 1944ピクセルの解像度で校正解剖スコープを持つ1.35X合計倍率で撮影しました。スケールバー=100μmです。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
図3： キャリブレーションと移行アッセイのC ounter の検証 。 （A）高品質のキャリブレーションされていない画像の典型的な例。遊走アッセイカウンタの再集計> '推奨サイズ」を使用して、（B）（A）の校正したバージョン。 （C）重要な地汚れや全体的な暗さと低画質膜の典型的な周波数プロット。 （D）ImageJのプラグインセルカウンターと遊走アッセイカウンタ自動カウントを使用して手動でカウントを比較する散布図。 （E）未校正の自動カウント対校正さの平均の差（％）を示す棒グラフ。データは、平均±SEです。 P <0.0001、N = 30、Welchのカレとの対応のないt検定ction。同じ画像がDに使用し、両方のE.キャリブレーションを再集計>「推奨サイズ」と再集計>で行われた「手動設定」をさらに最小サイズカウントされ、色のしきい値を絞り込みます。手動によるカウント調整は関数 'カウントで開く画像」を使用して行われませんでした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 細胞濃度カウンターのタイミングと遊走アッセイカウンタの 使用。 CCC校正時間の（A）の比較は、ユーザー1（CCC / TCの専門家）とユーザー2（CCC / TCの初心者）の間（1および2ステップ）。 （B）手動細胞計数回数が5試行にわたって平均及び分当たりカウント細胞で発現させました。電話交換C数は血球計室の9つの画像をキャプチャし、CCCでカウントする時間を平均することによって計算しました。使用される細胞濃度は〜1.15×10 6細胞/ mLでした。データは、平均±SEです。 n = 5（C）トランスウェルカウンターのタイミングは、3つのカテゴリにわたって比較した：取得（ACQ;手順7と8）、定量化（QNT、デフォルトの構成設定を使用して10.1-10.3.3ステップを）、および手動調整（ADJ; 10.4ステップ-1.4.2）。定量膜は正確なカウントのためにかなりの手動調整を必要とするために、バックグラウンド染色および破片の高度を有していました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
重要なステップ、トラブルシューティング、および制限
自動化された計算方法の性質上、粒子解析の特にそれらは、これらの粒子を定義するための数学的能力を必要とします。その結果、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタの両方の精度が撮影した画像は、細胞試料または遊走アッセイ膜に似ているつまり、どのように密接に、画像の忠実度にすぎなかっ依存しています。したがって、可能な限り最高のような顕微鏡及び関連するソフトウェア較正プロトコルに従う最上重要です。これは、バックグラウンドノイズを制限する不要パーティクルを低減すること、明るく均一に合焦画像を撮影し、TIFFなどの非非可逆ファイル形式で保存含みます。したがって、両方のプラグインは、これらの要件が満たされていない場合、誤った結果を生成する可能性があります。彼らがDOUBにするときの視覚的期待に一致するかどうかを決定するために、常にそのため、二重チェック細胞数にお勧めしますトン。実際の結果が一致しない場合は、二値画像と元の画像を比較すると、この問題（10.4ノートを）解明に役立つことがあります。いくつかのケースでは、より暗い遊走アッセイ画像はカラーしきい値限度内にあるピクセル値のためにカウントされた大きな領域を含んでいてもよいです。一般的に、フラットフィールド画像を使用すると、闇としみを除去し、色彩の凹凸に起因する最も不要なカウントを防ぐことができます。
これらの可能性と、比較的一般的な問題を考えると、ネイチャー・パブリッシング・グループなど13によって提案されているもののような標準的なイメージの整合性のガイドラインに従うことが重要です。一貫性のカウントを維持するために、一つの画像への調整は、すべての人に平等に適用されるべきです。これは、しかし、コントラスト、彩度、明度、利得に限定されるものではなく、そのような平均化、シャープネス、カラーフィルタなどのフィルタ。ガンマ調整は、ピクセルカラーの非直線的な変化を適用するように避けるべきであるので、別の各画像に影響を与え得ますLY 14。少数の細胞（<千）を使用して画像に共通の露光時間を適用する場合、これは、白とびや画像忠実度の損失をもたらすことができます。逆に、数千のセルを有する膜は、露出不足を防ぐために、より高い露光時間を必要とすることができます。したがって、達成可能な最高の画像忠実度を維持するために、可能な限り少ない、とする場合にのみ必要に応じて画像を調整するためのベストプラクティスです。
でも、高忠実度の画像で、真の粒子数が大幅に不要な粒子によって偏りが発生する場合があります。細胞濃度計算を使用する場合、試料は、細胞破片のかなりの量が含まれている場合、具体的に懸濁された細胞と同様の領域の、この結果をスキューすることができます。デブリを最小化することができない場合、いくつかのケースでは、これは、自動化解析を防ぐことができます。同様に、類似した色のバックグラウンド染色を高レベルで含む遊走アッセイ膜は、膜の裏面からの細胞または除去されなかった細胞を染色するために、可能性Iを生成しますnaccurate結果。これらの望ましくない粒子は、通常、いくつかの方法で削除することができます（10.4） 'カウントで開くイメージ'を介して、光源の明るさや露光時間を増加させ、より厳格であるとカラーしきい値を変更する、または手動で削除します。このプロトコルはCCCと精度を維持するためにTCに必要な画像の最適な品質を生成することに留意することが重要です。しかし、TCは、一般的にのみ手動で調整（10.4）に費やした多くの時間を必要とし、有意に低い品質、様々な倍率、または異なる色の汚れの画像をカウントすることが可能です。
任意の遊走アッセイ膜画像のキャリブレーション中、それを考慮に画像の解像度および細胞の相対的な大きさを取ることが重要です。前述したように、画質（Q）とキャリブレーション勧告（CR）は、粒子面積の周波数プロットの指標に依存しています。解析画像の、各セルは、1 /10万平均占有します総画像領域。小さなセルサイズ比を有するピクセルのわずか数百万の画像を使用する場合、細胞の大きさの変化も小さいです。すなわち、分散のみ10-60ピクセルの範囲であってもよい、です。画像面積率のセル面積が大きくなるようしかし、セルサイズの分布は、任意の所与の領域の周波数を減少させることにより、セルサイズ正規分布の尖度を減少させる、増加させます。明確な最小面積を決定することができないので、これは順番に、セル領域の自動計算がより困難または不可能にすることができます。同様に、これは、異なるセルサイズの周波数（<50）は非常に低くすることができる細胞のいくつかの数字を使用して画像に適用されます。本研究またはセルサイズの異なる分布で使用されるものとは異なる解像度の画像を解析する際に結果として、セルサイズ範囲の手動識別は、（10.3.3）が必要とされてもよいです。
意義と今後の方向
ImageJのプラグインセルカウンターは最初RELEました博士クルト・デ・ヴォスによって2001年にASEDし、この日に手動細胞計数のための主食を務めています。生物学的なコミュニティのために自由に利用できるツールの傾向を継続するには、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタは、スループットと移動アッセイの間、実験の再現性を高めるための無料ツールの次のステップを提供しています。遊走アッセイの最終結果は、播種した細胞の数に大きく依存します。 エルゴは、信頼性の細胞数は、再現性のために必要です。このように、CCCが原因細胞濃度および細胞の健康を維持し、より短いカウント倍の高い統計的確実性の両方に高い精度を提供しています。
また、両方のプラグインの最終結果は、細胞数のカウントではなく、例えば、蛍光などの相対的な指標です。様々な他のプロトコルは、染色した後、そのメジャー蛍光を存在するが、これらの方法は感度13の不足に悩まされています。 AdobeのPhotoshopは、独自の粒子解析トンを提供していますOOLが、プログラムは、使用のために購入しなければならないと遊走アッセイカウンタ20から利用可能なポスト計数分析を提供していません。両方のプラグインは、ImageJのから粒子計数機能に依存して、その結果のImageJによって使用されるマクロを編集することにより、エンドユーザによって修正することができます。これは、新しいマクロを作成することによって、他の粒子へのプラグインの範囲を拡大するためのユーザーのためのより大きな柔軟性を提供しています。カウント可能な粒子の幅を増加させ、エンドユーザーの貢献を組み込むための更なる開発は、次の論理的なステップです。自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析をセルカウンターの基本原則を組み合わせることにより、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。 http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins：プラグインはからのインストール手順とダウンロードのために自由に利用できます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 - 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides - Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293 | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth - 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
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