Automatiserad kvantifiering och analys av cellräkning Rutiner Använda ImageJ Plugins
Summary
This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.
Abstract
National Institute of Health ImageJ är en kraftfull, fritt tillgänglig bildbehandlingsprogram svit. ImageJ har omfattande partikelanalysalgoritmer som kan användas på ett effektivt sätt att räkna olika biologiska partiklar. Vid räkning stort antal cellprover, presenteras den hemocytometer en flaskhals med avseende på tiden. Likaså räknar membran från migration / invasionsanalyser med ImageJ plugin Cell Counter, även om korrekt, är exceptionellt arbetsintensiv, subjektivt, och ökända för att orsaka smärta i handleden. För att lösa detta behov har vi utvecklat två plugins i ImageJ för den enda uppgiften att automatisk hemocytometer (eller känd volym) och migration / invasion cellräkning. Båda plugins lita på förmågan att förvärva högkvalitativa mikrofotografier med minimal bakgrund. De är lätta att använda och optimerad för snabb räkning och analys av stora provstorlekar med inbyggda analysverktyg för att hjälpa kalibrering av räkningar. Genom att kombinera principen kärnans of Cell Counter med en automatiserad räkningsalgoritm och posträkningsanalys, ökar detta i hög grad den lätthet med vilken migrationsanalyser kan bearbetas utan någon förlust av noggrannhet.
Introduction
In vitro cellräkning är en viktig grundteknik i ett brett spektrum av vävnadsodlingsexperiment. Noggrann bestämning av antalet celler i en kultur är väsentlig för experimentell reproducerbarhet och standardisering 1,2. Cellräkning kan utföras manuellt med hjälp av en hemocytometer samt med hjälp av en mängd olika automatiserade metoder, alla med sina egna fördelar och nackdelar 3,4,5. De flesta av de automatiserade metoder för cellräkning tillhör en av två klasser, de som använder Coulter princip eller flödescytometri. Coulter räknare utnyttja celler elektriskt motstånd för att bestämma cellantalet och storlek. De är snabba, korrekta och billigare än flödescytometrar. Men de är sällan används för endast cellräkning på grund av deras betydande kostnader jämfört med manuell räkning 3. Flödescytometrar, å andra sidan, är dyra, men de har många tillämpningar, såsom cellräkning, analys av celler form, structure och mätning intern cellmarkörer 4,5. Maskiner som använder någon av dessa två principer finns tillgängliga från många tillverkare. Manuell räkning är prisvärda men tidskrävande och föremål för partiskhet medan automatiserade metoder kommer med en bråkdel av den tid som krävs för manuell räkning men med hjälp av dyra maskiner 6.
Andra vanliga cellodlingsförfaranden i cellrörlighet vitro, nämligen migration cell och invasion 7. Migration och invasionsanalyser används ofta för att undersöka cellrörligheten och invasivitet som svar på en kemotaktisk respons. Dessutom är de allmänt används för att studera embryonal utveckling, differentiering, inflammatoriskt svar, och metastas av multipla celltyper 7-11. Celler som har migrerat eller invaderade genom det porösa membranet av en migrationsanalys kan kvantifieras på två olika sätt. För det första genom färgning av cellerna med ett fluorescerande färgämne, dissociation from membranet, och kvantifiering med hjälp av en fluorescerande läsare 12. En begränsning med denna metod för kvantifiering är att ingen post kan kvarhållas av membranen och det finns ingen möjlighet för ytterligare analys 13. Den andra kvantifiering metod för migreras / invaderade celler som skall fixeras och färgas med fluorescerande färg eller mer allmänt, med cytologiska färgämnen såsom kristallviolett, toluidinblått eller hematoxylin; då celler kvantifieras manuellt med inverterade mikroskopiska bilder av dessa membran som är en mycket tidskrävande uppgift 12,13.
För att övervinna nackdelarna med manuell cellräkning genomfördes två tillförlitlig och exakt automatiserade cellräknare för cellkoncentrationen och för analysen migration utvecklats. Dessa automatiserade cellräknare algoritmer utvecklades för ImageJ som en plugin med hjälp av Oracles Java datorspråk. ImageJ är en offentlig och allmänt använd bildbehandling verktyg som utvecklats av National Institute of Health (NIH) 14,15; alltså, skriver dessa plugins för ImageJ underlättar enkel integrering i den biologiska.
Automatisering av cellräkning säkerställer hög genomströmning och reproducerbarhet jämfört med manuell räkning. Även andra tillgängliga program och plugins kan användas för att beräkna cellkoncentrationen genom bildanalys 5,16,17, cellkoncentration Calculator plugin är snabb och kan även hantera utspädningar av celler och behandlingar. Dessutom kan alla resultat och beräkningar från dessa två diskar sparas och exporteras. De två plugins som beskrivs i detta dokument är optimerade för användning av ett faskontrastmikroskop för levande cell imaging och stort synfält (hela membran capture) avbildning för migration analysmembran med hjälp av en dissekera omfattning. De plugins är fritt tillgängliga för nedladdning med installationsanvisningar från: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg, felsökning och begränsningar
Själva karaktären av automatiserade beräkningsmetoder, särskilt de av partikelanalys, kräver den matematiska förmåga att definiera dessa partiklar. Följaktligen är riktigheten i både cellkoncentrationen Calculator och migration analysräknaren majorly beroende på bilden trohet, det vill säga hur nära den tagna bilden liknar provcellen eller migrationsanalys membran. Det är därför av yttersta vikt att följa mikroskop och tillhörande…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.
Materials
| HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 – With L-Glutamine |
Fisher Scientific | SH3002702 | Cell culturing media |
| Fetal bovian serum (FBS) | GIBCO BRL | P00015 | Media suppliment |
| HTR8/SVneo trophoblast cell line | Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada) | Software is designed to work with any cell line. | |
| Trypsin | GIBCO BRL | 27250-018 | Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA 1X PBS |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| 10 cm cell culture plates | SARSTEDT | 833902 | Any tissue culture treated plates will be suitable |
| Transwell Polyester Membrane Inserts – 8.0µm Pore size | Costar 3422 ordered from Fisher Scientific | 7200150 | For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area |
| HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore – Soluntions 1, 2 & 3 | EMD Millipore and ordered from VWR | 65044A, B, & C | Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3) |
| Cotton Tipped Applicator | Puritan Medical | 806-WC | |
| Single-edge industrial razor blades | VWR | 55411 – 055 | Thickness: 0.30 mm (0.012") |
| Microscope Slides – Precleaned/Plain | Fisher Scientific | 12550A3 | Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm |
| Fisherbrand Cover Glasses – Rectangles no. 1 | Fisher Scientific | 12-545E | Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm |
| Fisher Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Leica Stereo dissecting microscope | Leica Microsystems | The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts: LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293, | |
| Hemacytometer | Assistant Germany | 0.100 mm Depth – 0.0025 mm2 | |
| Olympus inverted light microscope | Olympus Corporation | CKX41SF | The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2 |
| Laminar flow cabinet 1300 Series A2 | Thermo Scientific | Model: 1375 | Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | Model: 370 | Any cell culture incubator will be suitable – Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C |
| ImageJ | NIH | Version 1.50e | Minimum version required |
| Java Runtime Environment | Oracle | Version 1.8.0_66 | Minimum version required |
References
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016)
- Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
- Ormerod, M. G., Imrie, P. R., Walker, J. M., Pollard, J. W. Flow cytometry. Animal Cell Culture. , 543-558 (1990).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C., Stoddart, J. M. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , 7-12 (2011).
- Scott, W. N., Langdon, S. P. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , 225-229 (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
- Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
- Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
- Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
- Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
- Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
- Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
- . Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203 (2006).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
- . Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , (2016).
