Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Summary

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Mitochondrie remplissent un rôle important dans le métabolisme énergétique cellulaire, en particulier en utilisant de l'oxygène pour produire de l'adénosine triphosphate (ATP). Ils sont impliqués dans la mort cellulaire ainsi que dans plusieurs maladies humaines. la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) combine le transport d'électrons le long de la chaîne de transport d'électrons avec une consommation d'oxygène et la synthèse d'ATP. L'acide (TCA) le cycle tricarboxylique mitochondriale est impliqué dans la transformation des protéines, des glucides et des lipides riches en composés énergétiques comme nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de flavine – adénine – dinucléotide (FADH _2). Électrons du NADH et FADH ₂ sont ensuite transférés dans les complexes protéiques de la chaîne de transport d'électrons respiratoires (I à IV) se trouvant dans la membrane mitochondriale interne. En outre, deux autres voies redox peuvent transférer des électrons d'électrons chaîne de transport: i) mitochondrial d'électrons transfert flavoprotein (ETF), qui est situé sur la face de la matrice du mito intérieuremembrane chondrial, et fournit des électrons à partir d'acide gras β-oxydation; et ii) glycérophosphate déshydrogénase mitochondriale qui oxydent le glycérophosphate de dihydroxyacétone phosphate et alimente des électrons à la chaîne de transport d'électrons mitochondriale. Le complexe IV (l'accepteur d'électrons final) transfère les électrons à une molécule d'oxygène, la conversion de l'oxygène à deux molécules d'eau. Le déplacement des électrons de la chaîne respiratoire complexe de transport d'électrons I à IV est couplé avec le flux de protons à partir de la matrice mitochondriale dans l'espace intermembranaire, qui établit un gradient électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne. Ensuite, mitochondrial complexe V (ATP synthase) Navettes les ions d'hydrogène de nouveau dans la matrice mitochondriale et synthétise les molécules d'ATP. OXPHOS fonction peut être évaluée in vivo et in vitro en utilisant diverses techniques et divers états de la respiration mitochondriale peut être obtenue. Dans les mitochondries isolées du respirato suivantEtats Ry peuvent être mesurés: i) la respiration mitochondriale de base (état 1), ii) la consommation d'oxygène après l'addition des substrats spécifiques des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (état 2), iii) la consommation mitochondriale d'oxygène maximale après l'addition de concentrations saturantes adénosine diphosphate (ADP) (état 3) et, iv) repos respiration après la consommation ADP (converti en ATP) (état 4). Dans des cellules intactes les états respiratoires suivants peuvent être mesurés: i) la base de la consommation d'oxygène cellulaire en présence de substrats endogènes et de l'ADP, ii) la base de la consommation d'oxygène cellulaire en présence d'oligomycine (oligomycine insensible à la respiration) et oligomycine sensible à la respiration (ATP CA), iii) une respiration FCCP désaccouplé, et iv) la respiration mitochondriale non après l'addition de l'antimycine A et la roténone. Dans les cellules perméabilisées, des substrats spécifiques des complexes de la chaîne de transport d'électrons et de l'ADP peuvent être ajoutés et les taux maximaux respiratoires du complexe dépendantette I- aussi complexe, II- et respiratoire IV-dépendantes peut être mesurée.

Les mesures de la respiration cellulaire fournissent des informations importantes sur la capacité respiratoire mitochondriale spécifique aux complexes I-IV, l' intégrité mitochondriale et le métabolisme énergétique ^{1, 2, 3.} L' un des dispositifs qui permettent des mesures de la consommation d'oxygène mitochondrial avec une grande précision, la résolution et la sensibilité est la haute résolution oxygraphe ^4. Le dispositif à haute résolution oxygraphe contient deux chambres avec des orifices d'injection et chaque chambre est équipée d'un détecteur d'oxygène polarographique. suspensions mitochondriales cellulaires ou isolées sont agités en continu dans le spiromètre. Pour évaluer la fonction mitochondriale, substrats et inhibiteurs de l'activité complexe mitochondrial peuvent être ajoutés selon les protocoles standards. Substrats et inhibiteurs peuvent être titrés par injection into les chambres du oxygraphe, et les taux de consommation d'oxygène sont calculés en utilisant le logiciel et exprimée en picomoles par seconde et par nombre de cellules. Haute résolution respirométrie offre plusieurs avantages par rapport aux dispositifs d'électrodes oxygène polarographique traditionnelles et classiques, y compris une sensibilité accrue et la capacité de travailler avec un petit nombre d'échantillons biologiques tels que des cellules intactes ou perméabilisées. En outre, chaque appareil contient deux chambres, et les taux respiratoires peuvent être enregistrées simultanément pour les comparaisons des concentrations d'oxygène. La haute résolution oxygraphe présente également l'avantage de réduire les fuites d'oxygène à partir des chambres de l'appareil par rapport aux dispositifs traditionnels d'électrode polarographique à oxygène. Un autre dispositif récemment mis au point pour mesurer la consommation cellulaire d'oxygène est l'analyseur de flux extracellulaire de 96 puits ^5. L'analyseur de flux extracellulaire est équipé de fluorescence au lieu de capteurs polarographiques. Les avantages de l'extra-cellulaireanalyseur de flux par rapport à la haute résolution oxygraphe sont i) il est un dispositif largement automatisé, ii) il est possible de mesurer la consommation d'oxygène dans 24 et plaques à 96 puits pour le criblage à haut débit, ce qui nécessite donc des quantités plus faibles d'échantillons biologiques, et iii) la mesure supplémentaire de flux glycolytique cellulaire est possible. Les inconvénients de l'analyseur de flux extracellulaire par rapport à la haute résolution oxygraphe sont i) les coûts élevés de l'appareil et de consommables tels que des plaques fluorescentes, qui ne sont pas réutilisables, et ii) que quatre composés par essai / puits sont injectables par conséquent le système est réalisable pour des protocoles de titrage substrat découpleur inhibiteur.

Dans la présente étude, nous utilisons à haute résolution respirométrie pour déterminer la respiration mitochondriale. Pour les expériences cellulaires, la consommation d'oxygène, les cellules sont perméabilisées pour permettre l'entrée de l'ADP exogène et les substrats oxydables mitochondrial pour amener des électrons dans complexes du système respiratoire. Cette approche permet la dissection des complexes mitochondriaux individuels capacités respiratoires, ce qui est un avantage distinct par rapport aux cellules intactes (beaucoup de substrats sont des cellules impermeant). Cependant, la membrane cellulaire perméabilisation va perturber la barrière entre le cytosol et dans l'espace extracellulaire et moyen (lavage de solutés cytosolique) et la composition de l'espace intracellulaire est équilibrée avec le milieu extracellulaire. L'un des inconvénients des cellules perméabilisées par rapport aux cellules intactes est que la membrane externe mitochondriale peut être endommagée si des quantités excessives de détergent sont utilisés lors de la perméabilisation de la cellule. Dans des cellules intactes, de base, couplés et découplés respiration des cellules intactes peut être mesurée. Cette méthode évalue la consommation d'oxygène des cellules intactes, sans addition de substrats exogènes et de l'ADP, reproduisant la fonction respiratoire dans la cellule intégrée et fournissant également des informations sur transp d'électrons mitochondriale maximalecapacité rt ^{6, 7.} L'un des avantages des cellules intactes par rapport aux cellules perméabilisées est que l'environnement cellulaire ne soit pas perturbé et les mitochondries sont en contact avec les composants des cellules entières. Afin de perméabiliser la membrane plasmique cellulaire, des détergents tels que la digitonine ⁸ ont été utilisés. Cependant, l'intégrité de la membrane externe mitochondriale peut être compromise si des quantités excessives de digitonine sont employés. Pour confirmer que l'intégrité de la membrane externe mitochondriale ne soit pas compromise dans des cellules perméabilisées, le titrage est effectué digitonine afin de déterminer la concentration optimale pour la perméabilisation cellulaire. Pour ces expériences, les cellules sont remises en suspension dans du milieu de la respiration et de la concentration digitonine est titrée par respirométrie en présence de substrats et l'ADP et mitochondriales, les taux de respiration sont mesurés. Respiration des cellules intactes non perméabilisées n'a pas été stimulée en présence d'mitochosubstrats et ADP ndrial. Toutefois, après la titration de la digitonine par paliers produirait perméabilisation progressive des membranes plasmiques, et de la concentration optimale est obtenue digitonine. Cela est démontré par l'augmentation de la respiration jusqu'à la pleine perméabilisation. Qualité mitochondriale et de l' intégrité de la membrane externe peut être vérifiée en ajoutant exogène du cytochrome c ^{2, 9.} Cytochrome c est un électron 12 kDa portant la protéine mitochondriale de la chaîne de transport d'électrons ^{10, 11, 12.} Elle est localisée dans l'espace intermembranaire des mitochondries, et est impliqué dans la consommation d'oxygène, transportant des électrons de complexe III à IV complexe. Une fois que la membrane mitochondriale externe est endommagée, le cytochrome c est libéré, et de la consommation mitochondriale d'oxygène est réduite. Lors de l'addition exogène du cytochrome c, toute augmentation de la respiration mitochondriale est indicative d'unperturbé membrane externe mitochondriale.

Dans perméabilisées cellules, substrats et inhibiteurs de l' activité complexe mitochondrial sont ajoutés à la suite de différents protocoles ^{3, 9.} Par exemple, afin d'enquêter sur les taux respiratoires complexes induits-mitochondriales, le protocole suivant peut être utilisé. Après perméabilisation des cellules, premier complexe I est stimulée par les substrats du malate et du glutamate, qui génèrent NADH comme substrat pour la chaîne respiratoire et provoquer l'activation du complexe I. Par la suite, l'ADP est ajouté pour la conversion en ATP (état 3, actif complexe I-dépendante la respiration). Après un signal stable est atteint, la roténone (complexe mitochondrial I inhibiteur) est administré pour inhiber I. complexe roténone est suivie par le succinate de FADH ₂ et activer complexe II (état 3, actif complexe respiration II-dépendant). Afin de mesurer complexe IV-dépendante respiration, premier complexe IIIla respiration dépendante est inhibée par addition d'antimycine A (inhibiteur mitochondrial complexe III). Ensuite, complexe IV-dépendante la respiration est stimulée par l'administration d'ascorbate et tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD automatique peut s'oxyder dans le tampon de la respiration, donc complexe fréquence respiratoire maximale IV-dépendante (Etat 3) est calculé en soustrayant le taux de respiration avant et après l'addition de l'azoture de sodium, un inhibiteur du complexe IV mitochondriale. Les expériences de respiration peut être réalisée en deux chambres d'un oxygraphe en parallèle l'un servant de témoin (cellules non stimulées), l'autre contenant les cellules stimulées. De toute évidence, les cellules peuvent être pré-traitées de diverses manières, par exemple avec des médicaments qui affectent la fonction mitochondriale, avant leur consommation d'oxygène est mesurée dans la chambre de oxygraphe. Ce protocole permet l'examen fonctionnel des complexes individuels de la chaîne respiratoire mitochondriale. En outre, on peut mesurer l'ADP stimulée maximalerespiration (état 3) des cellules perméabilisées, en utilisant l'acide gras exogène sous forme de palmitate. Dans ce protocole, les stocks concentrés de palmitate de sodium sont conjugués avec l'acide gras ultra bovin libre de sérum-albumine (BSA) (6: 1 molaire palmitate: BSA). Ensuite, les cellules sont d'abord perméabilisées avec la respiration digitonine et mitochondriale est évaluée par l'addition de la carnitine et le palmitate suivi par l'addition d'ADP (état 3, la respiration maximale). Ensuite, oligomycine est ajouté à imiter l'état 4 (état 4o) et le rapport de contrôle respiratoire (valeur RCR) est calculé comme état 3 / état 4o. β-oxydation favorise la production d'acétyl – CoA réductase (qui entre dans le cycle TCA) et la génération de FADH ₂ et le NADH, les électrons qui sont transmis à la chaîne de transport d'électrons par flavoprotéine d'électrons de transfert et de β-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase. Les mitochondries sont au centre du métabolisme des acides gras et décrits protocole palmitate-BSA peut être utilisé par les chercheurs qui examinent la graissel'oxydation de l'acide ty. Dans des cellules intactes, des activateurs et des inhibiteurs de l' activité du complexe mitochondrial sont ajoutés selon un protocole différent , ^{6, 9.} Pour ces expériences, la première consommation d'oxygène des cellules non perméabilisées en l'absence de substrats exogènes est mesurée (phosphoryler la fréquence respiratoire). Ensuite, le taux de respiration non phosphorylant est mesuré après l'addition de l'oligomycine, qui est un inhibiteur de l'ATP synthase mitochondriale. Ensuite, le protonophore carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) est administré à différentes concentrations et la fréquence respiratoire mitochondriale découplé maximale est mesurée. Protonophores tels que FCCP peuvent induire une augmentation de la perméabilité des protons de la membrane interne, permettant un mouvement passif des protons pour dissiper le gradient chimiosmotique. Une augmentation de la perméabilité à protons découple la respiration oxydative (pas de production d'ATP) et induit une augmentation de l'oconsommation xygène. Ensuite, la roténone et antimycine A sont ajoutés pour inhiber la respiration mitochondriale et la respiration non-mitochondrial est soustraite de tous les autres taux respiratoires.

Les taux de consommation d'oxygène peuvent être exprimées comme IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 cellules] (débit d'oxygène par million de cellules) qui est calculé en divisant le flux d'oxygène spécifique en volume (dans la chambre à oxygène fermé), JV, O ₂ [pmol x s ^-1 x ml – ^1] de la concentration de cellules dans la chambre à cellules (nombre de cellules par volume [10 ⁶ cellules ∙ ¹ ml]) ^15. Cell-masse flux spécifique d'oxygène, JO ₂ [pmol x sec ^-1 x mg ^-1], est débit par cellule, IO ₂ [pmol x sec ^-1 x 10 ^-6 cellules], divisé par la masse par cellule [mg ∙ 10 ⁶ cellules]; ou le volume spécifique de flux, JV, O ₂ [pmol x sec ^-1 x ml ^-1], divisé par la masse par volume [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ est le flux d'oxygène par une protéine cellulaire, du poids sec ou de volume cellulaire.

Dans la présente étude, en utilisant à haute résolution respirométrie, nous décrivons des protocoles pour déterminer i) la concentration de la digitonine optimale pour toutes perméabilisation de la membrane plasmique cellulaire (essai de titrage digitonine), ii) l'intégrité de la membrane externe mitochondriale en utilisant exogène du cytochrome c, iii) les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I , fréquence respiratoire maximale II et IV dans les cellules HepG2 digitonine perméabilisées en présence d'ADP exogène et mitochondriales des substrats de la chaîne respiratoire, et iv) de base, associée et maximale respiration découplée (capacité maximale de transport d'électrons) des cellules intactes, sans addition de substrats exogènes et ADP, reproduisant la fonction respiratoire dans la cellule intégrée.

Protocol

1. Culture cellulaire La culture de cellules HepG2 d'hépatome humain 6 en flacons de 25 cm2 de culture cellulaire dans Modified Eagle du milieu de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans un incubateur (5% de CO 2, 95% d' air) (densité de semis: 1 x 10 6 cellules par 25 cm 2 de culture cellulaire flacon, le temps d'incubation dans l&…

Representative Results

Détermination de Optimum Digitonine Concentration Cellulaire perméabilisation: Digitonine Titration Experiment Digitonine titrage est effectué afin de déterminer la concentration optimale pour la perméabilisation des cellules HepG2. Pour ces expériences, la digitonine est titrée dans des cellules intactes en présence de la roténone, le succinate (mitochondriale complexe de substrat II) et une quantité saturante de l&#39…

Discussion

L'objectif du présent protocole était d'utiliser à haute résolution respirométrie pour mesurer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) des taux respiratoires, la capacité du système de transport d'électrons mitochondriale maximale et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Il y a quelques étapes critiques dans le présent protocole. Premièrement, les taux de consommation d'oxygène cellulaire sont généralement normalisées…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical