透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測
Summary
高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。
Abstract
A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.
Introduction
ミトコンドリアは、特に、アデノシン三リン酸（ATP）を生成するために酸素を使用することにより、細胞エネルギー代謝において重要な役割を果たす。それらは、細胞死を、いくつかのヒト疾患に関与しています。ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）の酸素消費量とATP合成に電子伝達鎖に沿った電子の移動を組み合わせます。ミトコンドリアのトリカルボン酸（TCA）サイクルは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）およびフラビンアデニンジヌクレオチドなどのエネルギーの豊富な化合物（FADH 2）へのタンパク質、炭水化物と脂肪の変換に関与しています。ミトコンドリア内膜に位置NADH及びFADH 2の電子その後（私はIVに）呼吸電子伝達鎖のタンパク質複合体に転写されます。また、他の二つの酸化還元経路は、トランスポート・チェーンを電子するために電子を転送することができた：i）ミトコンドリアの電子伝達フラビンタンパク質（ETF）の内側水戸のマトリックス面に配置されています脂肪酸β酸化からchondrial膜、および消耗品の電子;及びii）ジヒドロキシアセトンリン酸とグリセロホスフェートを酸化及びミトコンドリアの電子伝達鎖に電子を供給するミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ。複合体IV（最終的な電子受容体）は、水2分子に酸素を変換し、一つの酸素分子に電子を転送します。私はIVに呼吸電子伝達鎖複合体からの電子の移動は、ミトコンドリア内膜を横切る電気化学的勾配を確立する間腔へのミトコンドリアマトリックスからのプロトンの流れに結合されています。その後、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）が戻ってミトコンドリアマトリックスへの水素イオンを往復し、ATP分子を合成します。 OXPHOS機能を得ることができる種々の技術および種々のミトコンドリアの呼吸状態を用いて、in vivoおよびde vitroで評価することができます。単離ミトコンドリアにおける次respiratoRYの状態を測定することができた：i）基底ミトコンドリア呼吸（状態1）ミトコンドリア呼吸鎖複合体の特異的基質を添加した後、ii）の酸素消費量（状態2）、iii）の最大のミトコンドリアの酸素消費の飽和濃度の添加後アデノシン二リン酸（ADP）（状態3）と、ATPに変換ADP消費（後iv）の安静時の呼吸）（状態4）。無傷の細胞では、次の呼吸の状態を測定することができた：i）基底細胞性酸素消費内在性基質及びADPの存在下で、ⅱ）オリゴマイシンの存在下での基底の細胞の酸素消費量（オリゴマイシン非感受性呼吸）とオリゴマイシン感受性の呼吸（ATPターンオーバー）アンチマイシンAおよびロテノンを添加した後、III）FCCP脱共役呼吸、およびiv）非ミトコンドリア呼吸。透過性細胞、電子伝達系複合体およびADPを添加することができ、最大の複雑な依存性呼吸数秒の特異的基質でUCHのような複雑なI-は、II-およびIV-依存呼吸数を測定することができます。
細胞呼吸の測定は、複合体I-IV、ミトコンドリアの完全性およびエネルギー代謝1、2、3に固有のミトコンドリア呼吸容量重要な洞察を提供しています。高精度、分解能と感度のミトコンドリアの酸素消費量の測定を可能にする装置の一つは、高解像度oxygraph 4です。高解像度oxygraph装置は、注入ポートを有する2つのチャンバを含み、各チャンバはポーラログラフ酸素センサを備えています。携帯電話または単離されたミトコンドリア懸濁液は、呼吸計で連続的に攪拌されています。ミトコンドリア機能を評価するために、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、標準的なプロトコールに従って添加することができます。基質および阻害剤は、注射INTにより滴定することができますoxygraphのチャンバーO、および酸素消費速度は、ソフトウェアを用いて計算し、細胞数当たり毎秒ピコモルとして表されます。高解像度の呼吸計測は、感受性の増加や、無傷または透過性細胞のような生物学的サンプル数が少ないと連携する機能など、伝統的な従来のポーラログラフ酸素電極装置に比べていくつかの利点を提供しています。さらに、各デバイスは、2つのチャンバを含み、呼吸数、酸素濃度の比較のために同時に記録することができます。高解像度oxygraphは、従来のポーラログラフィー酸素電極装置に比べ機器室からの酸素の減少漏れの利点を有します。最近、細胞の酸素消費量を測定するために開発された他の装置は、96ウェルの細胞外フラックス分析器5です。細胞外フラックスアナライザーは、蛍光の代わりにポーラログラフセンサーが装備されています。細胞外の利点高解像度oxygraph Iである）は、II）は、24とハイスループットスクリーニングのために96ウェルプレート中に酸素消費量を測定することが可能であり、大部分が自動化されたデバイスであると比べてフラックス分析器は、従って、生物学的サンプルの低い量を必要とします及びiii）細胞の解糖フラックスの追加の測定が可能です。高解像度oxygraphと比較して細胞外フラックスアナライザーの欠点は、i）は、非再利用可能であり、装置のと、蛍光プレートなどの消耗品のコスト高、であり、およびii）アッセイ/ウェル当たりのみ4つの化合物は、注射可能です、したがって、システムは、基板脱共役剤 – 阻害剤滴定プロトコルのための現実的ではありません。
本研究では、我々は、ミトコンドリア呼吸を決定するために、高解像度の呼吸計測を使用します。細胞の酸素消費量の実験のために、細胞をCOMPLEXEに電子を供給するための外因性ADPおよび被酸化性ミトコンドリア基質の進入を可能にするために透過処理されています呼吸器系のS。このアプローチは、無傷の細胞（多くの基質が細胞非透過性である）に比べて明確な利点である個々のミトコンドリア複合体の呼吸能力の解剖を可能にします。しかし、細胞膜の透過性は、細胞外培地で平衡化され、サイトゾルおよび細胞外空間とメディア（サイトゾル溶質から洗い出さ）と細胞内空間の組成物との間の障壁を破壊します。無傷の細胞上の透過性細胞の欠点の一つは、洗浄剤の過剰量は、細胞透過の際に使用される場合、ミトコンドリア外膜が損傷することができることです。無傷細胞において、基礎、結合および無傷の細胞の脱共役呼吸を測定することができます。この方法は、統合された細胞中の呼吸機能を再現し、また、最大のミトコンドリア電子transpoに関する情報を提供する、外因性の基質およびADPを添加せずに無傷の細胞の酸素消費量を評価しますRT容量6、7。透過性細胞上無傷の細胞の利点の一つは、細胞環境が破壊されておらず、ミトコンドリアは、細胞の全構成要素に接触していることです。細胞の原形質膜を透過するために、例えば、ジギトニンなどの界面活性剤は、8使用されています。ジギトニンの過剰な量が使用される場合は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれる可能性があります。透過性細胞で損なわれないミトコンドリア外膜の完全性を確認するために、ジギトニン滴定は、細胞透過性のための最適濃度を決定するために行われます。これらの実験のために、細胞を、呼吸培地中に再懸濁し、ジギトニン濃度は、ミトコンドリアの基質及びADPの存在下での呼吸計測により滴定され、呼吸速度を測定します。無傷の、非透過性細胞の呼吸はmitochoの存在下で刺激されていませんndrial基板とADP。しかし、その後の段階的なジギトニン滴定は、原形質膜の漸進的な透過性をもたらすであろうし、最適なジギトニン濃度が得られます。これは、完全な透過への呼吸までの増加により示されています。ミトコンドリアの品質と外膜の完全性は、外因性のシトクロムc 2,9を追加することによって確認することができます。シトクロムcは、ミトコンドリア電子伝達系10、11、12の12 kDaの電子運搬タンパク質です。これは、複合体IVへの複合体IIIから電子を運ぶ、ミトコンドリアの膜間空間に局在し、酸素消費に関与しています。ミトコンドリアの外膜が損傷されると、シトクロムcが放出され、ミトコンドリアの酸素消費量が低減されます。外因性のシトクロムcの添加時に、ミトコンドリアの呼吸の任意の増強は、指標となりますミトコンドリア外膜を破壊しました。
透過処理した細胞では、ミトコンドリア複合体活性の基質および阻害剤は、さまざまなプロトコル3、9以下の追加されます。例えば、ミトコンドリア複合駆動型呼吸率を調べるために、以下のプロトコルを使用することができます。細胞の透過処理した後、最初の複合体Iは呼吸鎖の基質としてNADHを生成し、その後、ADPがATP（状態3、アクティブに変換するために追加された複雑なIの活性化を引き起こす基板リンゴ酸およびグルタミン酸によって刺激され、複合体I-依存呼吸）。安定した信号が到達した後、ロテノンは、（ミトコンドリア複合体I阻害剤）ロテノンはFADH 2にコハク酸が続いている複雑なIを阻害するために、複雑なII（状態3、活性複合体II依存呼吸）を活性化するために投与されます。複雑なIV-依存呼吸を測定するために、最初の複合体III依存性呼吸は、アンチマイシンA（ミトコンドリア複合体III阻害剤）を添加することにより阻害されます。その後、複雑なIV-依存呼吸はアスコルビン酸とtetramethylphenylendiamine（TMPD）を投与することにより刺激されます。 TMPDは、呼吸バッファーで自動酸化することができ、したがって、最大錯体IV依存性の呼吸速度（状態3）のアジ化ナトリウム、ミトコンドリア複合体IVの阻害剤の添加前および後の呼吸速度を減算することにより計算されます。呼吸実験は、コントロール（非刺激細胞）としてパラレル一oxygraphの二つのチャンバ、刺激された細胞を含む、他の中で行うことができます。明らかに、細胞は、それらの酸素消費はoxygraph室で測定される前に薬剤が、ミトコンドリアの機能に影響を与えて、 例えば 、様々な方法で前処理することができます。このプロトコルは、個々のミトコンドリア呼吸鎖複合体の機能的な検査を可能にします。また、一方が最大のADP刺激性を測定することができます透過性細胞の呼吸（状態3）、パルミチン酸の形で外因性の脂肪酸を用いて。 （1：1のモル比のパルミテート：BSA 6）このプロトコルでは、パルミチン酸ナトリウムの濃縮ストックを超脂肪酸フリーのウシ血清アルブミン（BSA）と結合しています。その後、最初のジギトニンとミトコンドリアの呼吸で浸透している細胞はカルニチンを添加することによって評価され、ADP（状態3、最大呼吸）を添加したパルミチン酸。そして、オリゴマイシン、状態4（状態40）を模倣するために追加され、呼吸調節比（RCR値）状態3 /状態40のように計算されます。 β酸化が（TCAサイクルに入る）アセチル-CoAの産生およびFADH 2及びNADHの生成を促進するの電子は、電子伝達フラビンタンパク質及びβヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼによって電子伝達鎖に渡されます。ミトコンドリア脂肪酸代謝の中心であり、パルミチン酸-BSAプロトコルを記載する脂肪を調べる研究者によって使用することができTY酸酸化。無傷細胞において、活性化剤およびミトコンドリア複合体活性の阻害剤は、異なるプロトコル6、9以下を添加します。これらの実験のために、外因性基質の非存在下での非透過性細胞の第1の酸素消費量は、（呼吸速度をリン酸化）を測定します。そして、非リン酸化呼吸数は、ミトコンドリアATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンの添加後に測定します。その後、プロトノフォアカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）を種々の濃度で投与され、最大のミトコンドリアの脱共役呼吸数を測定します。例えば、FCCPとしてProtonophoresは化学浸透勾配を放散するプロトンの受動的な動きを可能にする、内膜のプロトン透過性の増大を誘導することができます。プロトン透過性の増加は、酸化呼吸（無ATP産生）を脱共役し、Oの増加を誘導しxygen消費。その後、ロテノン及びアンチマイシンAは、ミトコンドリア呼吸を阻害するために添加され、そして非ミトコンドリア呼吸は、他のすべての呼吸数から減算されます。
酸素消費速度は、IO 2 [ピコモルX秒-1×10 -6細胞（閉酸素室で）体積固有の酸素フラックスを割ることによって計算される（細胞百万個当たりの酸素の流れ）、JV、Oのように表すことができます。細胞チャンバ内の細胞濃度（体積当たりの細胞数[10 6細胞∙ミリリットル1]）15によって2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]。細胞質量固有の酸素フラックス、JO 2 [X秒ピコモル-1 Xミリグラム-1]は、セル当たりの流れ、IO 2 [ピコモルのx秒-1×10 -6細胞】細胞当たりの質量で割った、[MG∙10 6セル];または体積固有フラックス、JV、O 2 [ピコモルのx秒-1のxミリリットル-1]、体積当たりの質量で割った値梅【MG∙ミリリットル1]。 JO 2は、細胞タンパク質、乾燥重量または細胞体積あたりの酸素流量です。
高解像度の呼吸計測を用いた本研究では、我々は私を決定するためのプロトコルを記述）は、完全な携帯形質膜透過性（ジギトニン滴定アッセイ）のための最適なジギトニン濃度、外因性のシトクロムcを用いて、ⅱ）ミトコンドリア外膜の完全性、iii）はミトコンドリア呼吸鎖複合体I外因性基質を添加することなく、外因性ADPとミトコンドリア呼吸鎖基質、および無傷の細胞のiv）の基礎、結合され、最大の脱共役呼吸（最大電子輸送容量）の存在下でのジギトニン透過処理HepG2細胞における、IIおよびIV最大呼吸数そしてADPは、統合された細胞内の呼吸機能を再現します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルの目的は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力およびミトコンドリア外膜の完全性を測定するための高解像度呼吸計測を使用することでした。
現在のプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、細胞の酸素消費速度は、通常、細胞の数に正規化される（ピコモル/ [セルの秒x個]）。し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant nº 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochimie. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).
