ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים
Summary
respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
Abstract
A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.
Introduction
המיטוכונדריה למלא תפקידים חשובים במטבוליזם האנרגיה בתאים, במיוחד באמצעות חמצן כדי לייצר אדנוזין אדנוזין (ATP). הם מעורבים מוות של תאים בכמה מחלות אנושיות. זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) משלב הובלת האלקטרונים לאורך שרשרת העברת אלקטרונים עם צריכת חמצן סינתזת ATP. החומצה tricarboxylic המיטוכונדריה (TCA) מחזור מעורב ההמרה של חלבונים, פחמימות ושומנים לתרכובות עתירות אנרגיה כמו dinucleotide אדנין nicotinamide (NADH) ו dinucleotide אדנין פלבין (FADH 2). אלקטרונים של NADH ו FADH 2 ואז מועברים קומפלקסי חלבוני שרשרת העברת אלקטרוני הנשימה (I עד IV) ממוקם קרום המיטוכונדריה הפנימי. בנוסף, שני מסלולי חיזור אחרים יכולים להעביר אלקטרוני אלקטרונים שרשרת תחבורה: i) המיטוכונדריה אלקטרון-העברת flavoprotein (ETF) הנמצא על פני המטריצה של מיטו הפנימיאלקטרוני קרום chondrial, ואספקת β-חמצון חומצות שומן; ו ii) dehydrogenase glycerophosphate המיטוכונדריה אשר מתחמצנים glycerophosphate כדי דהידרוקסיאצטון פוספט ומזינה אלקטרונים לשרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריה. IV המורכב (את מקבל אלקטרונים האולטימטיבי) מעביר את אלקטרוני מולקולת חמצן אחד, המרת חמצן שתי מולקולות של מים. העברת האלקטרונים מתסביך שרשרת העברת אלקטרוני נשימת I עד IV מצמידה עם תזרים פרוטון מן מטריקס המיטוכונדריה למרחב intermembrane הקובע שיפוע אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לאחר מכן, V מורכב המיטוכונדריה (synthase ATP) בהסעות יוני מימן בחזרה לתוך מטריקס המיטוכונדריה ו מסנתז מולקולות ATP. פונקצית OXPHOS ניתן להעריכם vivo ו במבחנה תוך שימוש בטכניקות שונות ומצבי נשימה המיטוכונדריאלי שונים ניתן לקבל. במיטוכונדריה בודדה את respirato הבאניתן למדוד מדינות ר"י: i) נשימה המיטוכונדריאלי הבזליים (מדינת 1), ii) צריכת חמצן לאחר התוספת של מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה (מצב 2), iii) צריכת חמצן מרבית המיטוכונדריה לאחר התוספת של להרוות ריכוזי diphosphate אדנוזין (ADP) (מצב 3) ו, ד) נשימה במנוחה לאחר צריכת ADP (המרה ל ATP) (מצב 4). בשנת תאי שלמי מדינות הנשימה הבאה ניתן למדוד: i) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות מצעי אנדוגני ADP, ii) צריכת חמצן הסלולר הבזליים בנוכחות oligomycin (oligomycin רישיות נשימה) ו oligomycin רגיש נשימה (ATP ממחזור), iii) FCCP נשימה זוגית, ו- IV) נשימה הלא המיטוכונדריה לאחר התוספת של antimycin ו rotenone. בתאי permeabilized, מצעים ספציפיים של מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים ו ADP ניתן להוסיף s שיעורי נשימה המקסימאלי תלויה מורכבuch אני- מורכב כמו, II- ושיעורי הנשימה IV תלויי ניתן למדוד.
מדידות של הנשימה התאית לספק תובנות חשובות קיבולת הנשימה במיטוכונדריה ספציפי מתחמי I-IV, יושרה המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים האנרגיה 1, 2, 3. אחד המכשירים המאפשרים מדידות של צריכת חמצן המיטוכונדריה עם רגישות דיוק, ברזולוציה גבוהה הוא oxygraph 4 ברזולוציה הגבוהה. מכשיר oxygraph ברזולוציה גבוהה מכיל שני תאים עם יציאות הזרקה וכל תא מצויד חיישן חמצן polarographic. השעיות המיטוכונדריה ניידות או מבודדות הם עוררו ברציפות respirometer. כדי להעריך המיטוכונדריה פונקציה, מצעים ומעכבים עבור פעילות מורכבת המיטוכונדריה ניתן להוסיף באי פרוטוקולים סטנדרטיים. מצעים ומעכבים ניתן טיטרציה ידי int הזרקהo לתאי של oxygraph, ושיעורי צריכת החמצן מחושבים באמצעות תוכנה כפי שבא לידי ביטוי picomoles לשנייה לכל מספר התאים. respirometry ברזולוציה גבוהה מציע מספר יתרונות על פני התקני אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים קונבנציונליים כולל רגישות מוגברת ואת היכולת לעבוד עם מספר קטן של דגימות ביולוגיות כגון תאים שלמים או permeabilized. בנוסף, כל התקן מכיל שני תאים, ושיעורי נשימה ניתן להקליט בו זמנית להשוואות של ריכוזי חמצן. Oxygraph ברזולוציה גבוהה גם יש את היתרון של דליפה המופחתת של חמצן מתאי המכשיר לעומת מכשירי אלקטרודה חמצן polarographic מסורתיים. מכשיר נוסף שפותח לאחרונה למדוד צריכת חמצן הסלולר הוא מנתח השטף התאי 96-גם 5. מנתח השטף התאי מצויד קרינה במקום חיישני polarographic. היתרונות של תאימנתח שטף לעומת oxygraph ברזולוציה הגבוהה הם i) הוא מכשיר אוטומטי במידה רבה, ii) ניתן למדוד צריכת חמצן 24- ו 96-גם צלחות להקרנת תפוקה גבוהה, ולכן דורש כמויות נמוכות של דגימות ביולוגיות, ו- III) מדידה נוספת של שטף הסלולר glycolytic אפשרית. החסרונות של הנתח השטף תאיים בהשוואה oxygraph ברזולוציה גבוהה הם i) העלויות הגבוהות של המכשיר ושל מתכלים כגון צלחות פלורסנט, רציפות שאינן לשימוש חוזר, ו-ב '), רק ארבע תרכובות לכל assay / גם הם להזרקה לכן, המערכת אינה ישימה עבור פרוטוקולי טיטרציה מצע-uncoupler-מעכב.
במחקר הנוכחי, אנו משתמשים respirometry ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע נשימה המיטוכונדריאלי. בניסויים צריכת החמצן הסלולר, התאים permeabilized כדי לאפשר כניסת ADP אקסוגניים מצעים המיטוכונדריה oxidizable האכלה אלקטרונים לתוך Complexeים של מערכת הנשימה. גישה זו מאפשרת לנתיחה קיבולות הנשימה מתחמי המיטוכונדריה הפרט, המהווה יתרון בולט לעומת תאים שלמים (מצעים רבים הם תאים impermeant). עם זאת, קרום התא permeabilization ישבש את המחסום בין cytosol והמרחב תאי והבינוני (לשטוף החוצה של מומסי cytosolic) והרכב של המרחב התאי הוא equilibrated עם המדיום התאי. אחד החסרונות של תאי permeabilized על תאים שלמים הוא כי הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להינזק אם כמויות עודפות של חומר ניקוי מועסקות במהלך permeabilization תא. בשנת תאים שלמים, הבזליים, מצמיד ונשימה זוגית של תאי שלמים ניתן למדוד. שיטה זו מעריכה צריכת חמצן של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ADP, לשחזר את תפקודי הנשימה בתא המשולב גם מתן מידע על transpo אלקטרון המקסימאלי המיטוכונדריהקיבולת 6 rt, 7. אחד היתרונות של תאים שלמים מעל תא permeabilized הוא כי הסביבה הסלולר אינה מופרת המיטוכונדריה נמצאת בקשר עם הרכיבים השלמים של התאים. כדי permeabilize הממברנה התאית, דטרגנטים כגון digitonin שימשו 8. עם זאת, שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה יכולה להיפגע אם כמויות עודפות של digitonin מועסקות. כדי לאשר שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה לא נפגעת בתאי permeabilized, טיטרציה digitonin מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור permeabilization הסלולר. בניסויים אלה, תאי resuspended במדיום נשימה וריכוז digitonin הוא טיטרציה ידי respirometry בנוכחות מצעים המיטוכונדריה ADP, ושיעורי נשימה נמדדים. נשימה של שלם, שאינו permeabilized תאים אינו מגורה בנוכחות mitochoמצעי ADP ndrial. עם זאת, טיטרציה digitonin בשלבים הבאה תניב permeabilization ההדרגתית של ממברנות פלזמה, וריכוז digitonin אופטימלי מתקבל. זו מוצגת על ידי הגידול של נשימה עד permeabilization מלא. איכות מיטוכונדריאלי ויושרת קרום חיצונית יכולים להיות מאומתת על ידי הוספת ג 2 ציטוכרום אקסוגניים, 9. ציטוכרום C הוא חלבון נושאת אלקטרון 12 kDa של שרשרת העברת אלקטרונים המיטוכונדריה 10, 11, 12. זה הוא מקומי במרחב intermembrane המיטוכונדריה, והוא מעורב צריכת חמצן, נושאת אלקטרונים מורכב III ל- IV המורכב. לאחר הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה פגומה, ציטוכרום C הוא שוחרר, וצריכת חמצן המיטוכונדריה מצטמצמת. עם התוספת של ציטוכרום C אקסוגניים, הגדלה שום נשימה המיטוכונדריאלי היא מעידה עלשיבשו הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
בתאי permeabilized, מצעים ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבאים פרוטוקולים שונים 3, 9. לדוגמה כדי לחקור שיעורי נשימה מונחה מורכב המיטוכונדריה, הפרוטוקול הבא יכול לשמש. לאחר permeabilization של תאים, אני המתחם הראשון הוא מגורה על ידי malate מצעים ו גלוטמט, אשר יוצרים NADH כמו מצע לשרשרת הנשימה לעורר את ההפעלה של I. מורכבים לאחר מכן, ADP מתווסף לגיור ל- ATP (המדינה 3, פעיל אני תלוי מורכב נשימה). לאחר אות יציבה הוא הגיע, rotenone (מורכב המיטוכונדריה שאני מעכב) מנוהל לעכב I. מורכב Rotenone ואחריו succinate כדי FADH 2 וכדי להפעיל מורכבים שניים (מדינת 3, השני תלויה נשימה מורכבת פעילה). על מנת למדוד מורכבות נשימת IV תלוי, המתחם ראשון IIIנשימה תלויה מעוכבת על ידי הוספת antimycin (מעכב המורכב III המיטוכונדריה). לאחר מכן, נשימת IV התלוי מורכבת היא מגורה על ידי מתן ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD יכול אוטומטי לחמצן למאגר הנשימה, ולכן קצב נשימת IV התלוי המורכב המקסימאלי (המדינה 3) מחושב על ידי הפחתת שיעורי נשימה לפני ואחרי התוספת של אזיד הנתרן, מעכב IV המורכב המיטוכונדריה. ניסויי הנשימה יכולים להתבצע בשני תאים של oxygraph במקביל-מנה אחת כביקורת (תאי unstimulated), את מכיל אחרים התאים המגורים. ברור, התאים ניתן מראש לטפל בדרכים שונות, למשל, עם תרופות המשפיעות פונקציות המיטוכונדריה, לפני צריכת החמצן שלהם נמדדה בתא oxygraph. פרוטוקול זה מאפשר בדיקה תפקודית של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה הפרט. בנוסף, אפשר למדוד ADP מגורה מקסימלינשימה (מדינה 3) של תאי permeabilized, באמצעות חומצת שומן אקסוגניים בצורת palmitate. בפרוטוקול זה, מניות מרוכזות של palmitate נתרן מצומדות עם אלבומין בסרום שור חינם חומצת שומן אולטרה (BSA) (6: palmitate יחס 1 הטוחן: BSA). לאחר מכן, התאים הראשונים הם permeabilized עם הנשימה digitonin ואת המיטוכונדריה נבחנת על ידי תוספת של קרניטין palmitate ואחריו תוספת של ADP (מצב 3, הנשימה מקסימלי). לאחר מכן, מתווסף oligomycin לחקות מדינה 4 (4O מדינה) ויחס מלא נשימה (ערך RCR) מחושב מדינה 3 / מדינה 4O. β-חמצון מקדם ייצור של אצטיל COA (אשר נכנס במחזור TCA) ויצירת FADH 2 ו NADH, האלקטרונים הם צולח לשרשרת הובלת אלקטרונים על ידי flavoprotein העביר-אלקטרוני dehydrogenase β-hydroxyacyl-CoA reductase. המיטוכונדריה הם במרכז מטבוליזם חומצות שומן ותיאר פרוטוקול palmitate-BSA יכול לשמש את החוקרים לבחון שומןחמצון חומצה ty. בשנת תאים שלמים, activators ומעכבים של פעילות מורכבת המיטוכונדריה מתווספים הבא בפרוטוקול אחר 6, 9. בניסויים אלה, צריכת החמצן הראשונה של תאים שאינם permeabilized בהעדר מצעים אקסוגניים נמדדת (phosphorylating קצב הנשימה). לאחר מכן, קצב הנשימה הלא phosphorylating נמדד לאחר תוספת של oligomycin, שהוא מעכב של ה- ATP synthase המיטוכונדריה. לאחר מכן, ציאניד קרבוניל protonophore p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) מנוהל בריכוזים שונים ואת קצב הנשימה הזוגי המקסימאלי המיטוכונדריה נמדד. Protonophores כגון FCCP יכול להשרות הגדלה בחדירות פרוטון של הקרום הפנימי, המאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים כדי להפיג את שיפוע chemiosmotic. גידול חדיר פרוטון uncouples נשימת חמצונים (לא מבוצע ייצור ATP) ומשרת גידול oצריכת xygen. לאחר מכן, rotenone ו- A antimycin מתווספים לעכב נשימה המיטוכונדריאלי, והנשימה הלא המיטוכונדריה מופחתת מכל שיעורי הנשימה האחרים.
שיעורי צריכת החמצן יכולים לבוא לידי ביטוי 2 IO [pmol x שניות -1 x 10 -6 תאים] (זרימת חמצן למיליון תאים) המחושבות על ידי חלוקת שטף חמצן ספציפי נפח (בתא החמצן הסגור), JV, O 2 [sec x pmol -1 x מ"ל -1] על ידי ריכוז תא לתא הסלולרי (מספר התאים לכל נפח [10 6 תאים ∙ מ"ל 1]) 15. Cell-מסת שטף חמצן ספציפי, 2 JO [sec x pmol -1 x מ"ג -1], היא זרימה לכל תא, IO 2 [sec x pmol -1 x 10 -6 תאים], מחולק המוני לכל תא [מ"ג ∙ 10 6 תאים]; או נפח ספציפי השטף, JV, O 2 [sec x pmol -1 x מ"ל -1], מחולק המוני לכל כרךume [מ"ג ∙ מ"ל 1]. JO 2 הוא שטף החמצן לכל חלבון תא, משקל יבש או נפח תא.
במחקר הנוכחי באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה, אנו מתארים פרוטוקולים לקבוע i) digitonin הריכוז האופטימלי עבור permeabilization קרום הפלזמה הסלולר שלם (assay טיטרציה digitonin), ii) שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה באמצעות ציטוכרום C אקסוגניים, iii) מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה לי , שיעורי נשימה מקסימאליים II ו- IV בתאי HepG2-permeabilized digitonin בנוכחות ADP אקסוגניים מצעי שרשרת נשימה במיטוכונדריה, ו- IV) הבזליים, מצמיד ונשימה מקסימלי זוגית (קיבולת העברת אלקטרונים מקסימלי) של תאים שלמים בלי התוספת של מצעים אקסוגניים ו ADP, לשחזר את תפקודי נשימה בתא המשולב.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.
ישנם כמה צעדים ק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant nº 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochimie. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).
