De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Summary

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

As mitocôndrias desempenham papéis importantes no metabolismo da energia celular, especialmente através da utilização de oxigénio para a produção de trifosfato de adenosina (ATP). Eles são implicados na morte de células e em várias doenças humanas. fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) combina transporte de elétrons ao longo da cadeia de transporte de elétrons com o consumo de oxigênio e síntese de ATP. O ciclo mitocondrial tricarboxílico (TCA) está envolvido na conversão de proteínas, hidratos de carbono e gorduras, em compostos ricos em energia como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) e flavina adenina dinucleótido (FADH _2). Os electrões do NADH e _FADH2, em seguida, são transferidos para os complexos de proteína de transporte de electrões da cadeia respiratória (I a IV) localizado na membrana mitocondrial interna. Além disso, dois outros percursos redox pode transferir electrões para corrente de transporte: i) mitocondrial de electrões transferência flavoproteína (FEF), que está localizado na face da matriz interior Mitomembrana condral, e fornece elétrons de ácidos graxos β-oxidação; e ii) glicerofosfato desidrogenase mitocondrial que oxida glicerofosfato de fosfato de dihidroxiacetona e alimenta elétrons para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. IV Complex (o receptor de elétrons final) transfere os elétrons a uma molécula de oxigênio, convertendo oxigênio para duas moléculas de água. Movendo dos electrões do complexo cadeia de transporte electrónico respiratório I a IV é acoplado com o fluxo de protões a partir da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar que estabelece um gradiente electroquímico através da membrana interna mitocondrial. Depois, mitocondrial complexo V (ATP sintase) transporta os íons de hidrogênio de volta para a matriz mitocondrial e sintetiza moléculas de ATP. OXPHOS função pode ser avaliada in vivo e in vitro utilizando várias técnicas e vários estados da respiração mitocondrial pode ser obtido. Em mitocôndrias isoladas a seguinte influencestados Ry pode ser medido: i) basal respiração mitocondrial (estado 1), ii) o consumo de oxigénio após a adição de substratos específicos dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (estado 2), iii) o consumo de oxigénio mitocondrial máxima após a adição de concentrações saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) e, iv) a respiração de repouso após o consumo de ADP (convertido em ATP) (estado 4). Em células intactas as seguintes estados respiratórios podem ser medidos: i) consumo de oxigénio celular basal, na presença de substratos endógenos e ADP, ii) o consumo de oxigénio celular basal, na presença de oligomicina (oligomicina-insensível respiração) e oligomicina-sensível respiração (ATP volume), iii) FCCP respiração desacoplado, e iv) a respiração não-mitocondrial após a adição de antimicina a e rotenona. Em células permeabilizadas, podem ser adicionados os substratos específicos dos complexos de cadeia de transporte electrónico e máximas de ADP e dependente de complexos s taxas respiratóriasuch I- tão complexo, II- e respiratória IV-dependentes podem ser medidos.

As medições da respiração celular fornecem importantes insights sobre a capacidade respiratória mitocondrial específico para complexos I-IV, integridade mitocondrial eo metabolismo ^{1, 2, 3} energia. Um dos dispositivos que permitem que as medições de consumo de oxigénio mitocondrial com alta precisão, sensibilidade e resolução é o oxygraph de alta resolução ^4. O dispositivo de alta resolução oxygraph contém duas câmaras com as portas de injecção e cada câmara está equipada com um sensor de oxigénio polarográfica. suspensões mitocondriais celulares ou isoladas são agitados continuamente no respirometer. Para avaliar a função mitocondrial, substratos e inibidores de atividade complexa mitocondrial podem ser adicionados de acordo com protocolos padrão. Os substratos e inibidores pode ser titulado por injecção into as câmaras do oxygraph, e as taxas de consumo de oxigênio são calculados usando o software e expressa como picomoles por segundo por número de células. De alta resolução ventilometria oferece várias vantagens sobre dispositivos eletrodo de oxigênio polarographic tradicionais e convencionais, incluindo aumento da sensibilidade ea capacidade de trabalhar com um pequeno número de amostras biológicas, tais como células intactas ou permeabilizadas. Além disso, cada dispositivo contém duas câmaras, e taxas respiratórias podem ser gravados simultaneamente para as comparações das concentrações de oxigénio. O oxygraph de alta resolução, também tem a vantagem de redução das fugas de oxigénio a partir das câmaras do dispositivo em relação aos dispositivos de eléctrodos de oxigénio polarográficos tradicionais. Outro dispositivo recentemente desenvolvido para medir o consumo de oxigênio celular é a de 96 poços analisador de fluxo extracelular ^5. O analisador de fluxo extracelular está equipado com sensores de fluorescência em vez de polarografia. As vantagens da extracelularanalisador de fluxo em comparação com o oxygraph de alta resolução são i) é em grande parte um dispositivo automatizado, ii), é possível medir o consumo de oxigénio em 24 e placas de 96 poços para rastreio de elevado rendimento, necessitando de menores quantidades de amostras biológicas, e iii) medição adicional do fluxo glicolítico celular é possível. As desvantagens do analisador de fluxo extracelular em comparação com o oxygraph de alta resolução são: i) os elevados custos do dispositivo e de bens de consumo, tais como placas fluorescentes, que são não reutilizáveis, e ii) apenas quatro compostos por ensaio / poço são injectável , por conseguinte, o sistema não é praticável para protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor.

No presente estudo, utilizamos de alta resolução respirometria para determinar respiração mitocondrial. Para as experiências de consumo de oxigénio celulares, as células são permeabilizadas para permitir a entrada de ADP exógeno e mitocondriais substratos oxidáveis ​​para a alimentação de electrões em complexes do sistema respiratório. Esta abordagem permite a dissecção de complexos mitocondriais individuais capacidades respiratórias, o que é uma vantagem distinta em relação a células intactas (muitos substratos são de célula-impermeabilizante). No entanto, a permeabilização da membrana celular irá perturbar a barreira entre o citosol e o espaço extracelular e forma (lavagem de solutos citosólicas) e a composição do espaço intracelular é equilibrada com o meio extracelular. Uma das desvantagens de células permeabilizadas sobre células intactas é que a membrana mitocondrial externa pode ser danificado se quantidades excessivas de detergente são empregues durante a permeabilização celular. Em células intactas, basal, respiração das células intactas acoplado e desacoplado pode ser medido. Este método avalia o consumo de oxigénio de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado e também fornecer informação sobre máxima transpo de electrões mitocondrialcapacidade rt ^{6, 7.} Uma das vantagens de células intactas sobre células permeabilizadas é que ambiente celular não é interrompido e as mitocôndrias são em contacto com toda a componentes das células. A fim de permeabilizar a membrana plasmática celular, tais como detergentes digitonina foram utilizados ^8. No entanto, a integridade da membrana exterior mitocondrial pode ser comprometida se são empregues quantidades excessivas de digitonina. Para confirmar que a integridade da membrana mitocondrial externa não está comprometida em células permeabilizadas, a titulação é efectuada de digitonina para determinar a concentração óptima para permeabilização celular. Para estas experiências, as células são ressuspensas em meio de respiração e concentração de digitonina é titulado por ventilometria na presença de substratos mitocondriais e ADP, e taxas respiratórias são medidos. Respiração de células intactas, não-permeabilizadas não é estimulado na presença de mitochondrial substratos e ADP. No entanto, a titulação subsequente digitonina gradual renderia permeabilização gradual de membranas de plasma, e a concentração óptima é obtida digitonina. Isto é mostrado pelo aumento da respiração até permeabilização completo. Mitocondrial qualidade e integridade da membrana externa pode ser verificada por adição exógena citocromo c ^{2, nove.} Citocromo c é uma proteína transportando 12 elétrons kDa da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons ^{10, 11, 12.} Ele está localizado no espaço intermembranar mitocondrial, e está envolvido no consumo de oxigénio, transportar electrões do complexo III a IV complexo. Uma vez que a membrana mitocondrial externa está danificado, citocromo c é liberado, e o consumo de oxigénio é reduzida mitocondrial. Após a adição de citocromo c exógeno, qualquer aumento na respiração mitocondrial é indicativo de uminterrompido membrana mitocondrial externa.

Em células permeabilizadas, substratos e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados seguindo vários protocolos de ^{3, 9.} Por exemplo, a fim de investigar as taxas respiratórias-driven complexos mitocondriais, o protocolo seguinte pode ser usado. Após a permeabilização das células, o primeiro complexo I é estimulada pela malato substratos e glutamato, os quais geram o NADH como um substrato para a cadeia respiratória e provocam a activação do complexo I. Em seguida, o ADP é adicionado para a conversão de ATP (estado 3, activa complexo I-dependente respiração). Depois de um sinal estável seja alcançado, rotenona (complexo I mitocondrial inibidor) é administrado para inibir complexo I. rotenona é seguido por succinato de FADH ₂ e para activar o complexo II (estado 3, activa complexo respiração II-dependentes). A fim de medir a respiração dependente do complexo IV, primeiro complexo IIIrespiração -dependente é inibida pela adição de antimicina A (inibidor mitocondrial complexo III). Em seguida, a respiração complexo dependente de IV é estimulado através da administração de ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD pode auto-oxidam no buffer de respiração, por conseguinte, a taxa de respiração máxima complexo dependente de IV (estado 3) é calculada subtraindo-se as taxas respiratórias antes e depois da adição de azida de sódio, um inibidor do complexo mitocondrial IV. As experiências de respiração pode ser levada a cabo em duas câmaras de um oxygraph em paralelo um servindo como um controlo (células não estimuladas), o outro contendo as células estimuladas. Obviamente, as células podem ser pré-tratados de várias maneiras, por exemplo, com drogas que afectam funções mitocondriais, antes de o seu consumo de oxigénio é medida na câmara de oxygraph. Este protocolo permite o exame funcional dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial individuais. Além disso, pode-se medir a ADP-estimulada máximarespiração (estado 3) de células permeabilizadas, utilizando ácido gordo exógeno sob a forma de palmitato. Neste protocolo, as ações concentradas de palmitato de sódio são conjugados com ácido graxo de ultra albumina do soro bovino livre (BSA) (6: 1 proporção molar de palmitato: BSA). Em seguida, as células são primeiro permeabilizadas com digitonina e a respiração mitocondrial é avaliada pela adição de carnitina e ácido palmítico, seguido pela adição de ADP (estado 3, respiração máxima). Então, oligomicina é adicionado para imitar o estado 4 (estado 4o) e índice de controlo respiratório (valor RCR) é calculado como o estado 3 / estado 4o. β-oxidação promove a produção de acetil-CoA (que entra no ciclo do TCA) e geração de FADH ₂ e NADH, os electrões dos quais são passados para a cadeia de transporte de electrões por flavoproteína de transferência de electrões e β-hidroxiacil-CoA-desidrogenase. As mitocôndrias são colocados no centro do metabolismo do ácido gordo e descrito protocolo palmitato-BSA pode ser usado por investigadores examinam gorduraa oxidação de ácidos Ty. Em células intactas, ativadores e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados na sequência de um protocolo diferente ^{6, 9.} Para estas experiências, primeiro o consumo de oxigénio de células não-permeabilizadas, na ausência de substratos exógenos é medido (fosforilar taxa de respiração). Em seguida, a taxa de respiração de não-fosforilação é medida após a adição de oligomicina, que é um inibidor da ATP sintase mitocondrial. Em seguida, o cianeto de carbonilo protonophore p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) é administrado em várias concentrações e a taxa respiratória mitocondrial desacoplada máxima é medida. Protonophores tais como FCCP pode induzir um aumento na permeabilidade de protões da membrana interior, permitindo o movimento passivo de protões para dissipar o gradiente quimiosmótica. Um aumento na permeabilidade de protões desacopla respiração oxidativo (sem a produção de ATP) e induz um aumento na óconsumo xygen. Depois, rotenona e antimicina A são adicionados para inibir a respiração mitocondrial, e a respiração mitocondrial não é subtraída de todas as outras taxas respiratórias.

As taxas de consumo de oxigénio pode ser expresso como ₂ IO [pmol x ^seg-1 x 10 células ^-6] (fluxo de oxigénio por milhão de células) que é calculado dividindo-se o fluxo de oxigénio específicos do volume (em oxigénio na câmara fechada), JV, ó ₂ [pmol x seg ^-1 x ^ml-1], através da concentração de células na câmara de células (número de células por volume [10 ⁶ células ∙ ml ^{1]) 15.} Cell-massa fluxo de oxigênio específico, JO ₂ [pmol x seg ^-1 x mg ^-1], é o fluxo por célula, IO ₂ [pmol x seg ^-1 x 10 ^-6 células], divididos em massa por célula [mg ∙ 10 ⁶ células]; ou específicos de volume de fluxo, JV, O ₂ [pmol x seg ^-1 x ml ^-1], dividido por massa por volume [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ é o fluxo de oxigénio por proteína de células, peso seco ou volume celular.

No presente estudo, usando alta resolução ventilometria, que descrevem protocolos para determinar i) concentração óptima de digitonina para completa a permeabilização da membrana do plasma celular (ensaio de titulação de digitonina), ii) a integridade mitocondrial externa da membrana utilizando exógeno citocromo c, iii) complexos da cadeia respiratória mitocondrial I , II e IV as taxas respiratórias máximas em células HepG2 permeabilizadas-digitonina, na presença de ADP exógeno e substratos da cadeia respiratória mitocondrial, e iv) basal, acoplado e máxima respiração desacoplado (capacidade de transporte de electrões máxima) de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado.

Protocol

Cultura 1. celular Células de cultura de hepatoma humano HepG2 6 em 25 centímetros 2 frascos de cultura de células em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa incubadora (5% de CO 2, 95% de ar) (densidade de sementeira: 1 X 10 6 células por balão de cultura de 25 centímetros de células 2, tempo de incubação na incubado…

Representative Results

Determinação da Optimum Digitonin Concentração para Cellular permeabilização: Digitonin Titulação Experiment A digitonina da titulação é efectuada para determinar a concentração óptima para permeabilização das células HepG2. Para estas experiências, a digitonina é titulado em células intactas na presença de rotenona, succinato (complexo mitocondrial substrato II) e uma quantidade saturante de ADP (que induzem…

Discussion

O objetivo do presente protocolo foi a utilização de alta resolução respirometria para medir mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, a capacidade do sistema de transporte de elétrons mitocondrial máxima e integridade mitocondrial externa da membrana.

Existem alguns passos críticos dentro do presente protocolo. Em primeiro lugar, as taxas de consumo de oxigénio celular são geralmente normalizados para o número de células (pmol / [seg x númer…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical