Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için
Summary
Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.
Abstract
A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.
Introduction
Mitokondri, özellikle adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksijen ile, hücresel enerji metabolizmasında önemli rolleri üstlenirler. Bu hücre ölümü ve çeşitli insan hastalıklarında implike edilmiştir. Mitokondrial oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) oksijen tüketimi ve ATP sentezi ile elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşıma birleştirir. Mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsü nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin dinükleotit enerji bakımından zengin bileşimler (FADH 2) içine protein, karbonhidrat ve yağ arasında dönüşüm yer almaktadır. NADH ve FADH 2 elektronlar solunum elektron taşıma zinciri protein kompleksleri aktarılır (I IV), iç mitokondriyal zarın yer. Buna ek olarak, diğer iki redoks yolları ulaşım zinciri elektron elektron aktarabilirsiniz: i) mitokondriyal elektron-transfer flavoprotein (ETF), iç mito matris yüzünde yer almaktadıryağ asidi β-oksidasyon chondrial membran ve malzemeleri elektronlar; ve ii) dihidroksiaseton fosfat gliserofosfat oksitlenir ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri elektronları besleyen mitokondriyal gliserofosfat dehidrojenaz. Kompleks IV (elektron kabul eden) su, iki molekül oksijen dönüştürülmesi, tek bir oksijen molekülüne transfer eder. I'den IV'e kadar solunum elektron taşıma zinciri kompleksi elektron taşıma mitokondriyal iç membran boyunca bir elektrokimyasal gradyanı oluşturur arası boşluğa mitokondriyal matris proton akışı ile birleştirilir. Daha sonra, mitokondriyal kompleks V (ATP sentaz) geri mitokondrial matriks içine hidrojen iyonlarını mekik ve ATP molekülleri sentezler. OXPHOS fonksiyonu elde edilebilir çeşitli teknikler ve çeşitli mitokondriyal solunum durumları kullanılarak in vivo ve in vitro olarak değerlendirilebilir. İzole mitokondri aşağıdaki respirato içindeRy Devletler ölçülebilir: i) taban mitokondriyal solunum (durum 1) mitokondriyal solunum zinciri kompleksi, belirli alt-tabakaların ilave edildikten sonra, ii) oksijen tüketimi (durum 2), III) maksimal mitokondriyal oksijen tüketimi doyurucu konsantrasyonlarının ilave edildikten sonra adenozin difosfat (ADP) (devlet 3) ve ATP dönüştürülür ADP tüketimi (sonra iv) istirahat solunum) (devlet 4). sağlam hücrelerde takiben solunum durumları ölçülebilir: i) taban hücresel oksijen tüketimi endojen substratları ve ADP mevcudiyetinde, ii) oligomycin varlığında bazal hücre oksijen tüketimi (oligomycin hassas olmayan solunum) ve oligomycin duyarlı solunum (ATP kaybı) antimisin ve rotenone ilave edilmesinden sonra, iii) FCCP bağlanmamış solunum, ve iv) olmayan mitokondriyal solunum. permeabilize hücrelerde, elektron taşıma zinciri kompleksleri ve ADP özel substratlar eklendi ve maksimal kompleks bağımlı solunum hızları ler olabiliruch gibi karmaşık I-, II- ve IV-bağımlı solunum oranları ölçülebilir.
Hücresel solunum ölçümleri kompleksleri I-IV, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması 1, 2, 3 özel mitokondriyal solunum kapasitesi önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek doğruluk, çözünürlük ve hassasiyet ile mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri sağlayacak cihazlardan biri yüksek çözünürlüklü Oksigraf 4'tür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf cihaz enjeksiyon portu ile iki bölmeyi içerir ve her bölme bir polarografik oksijen sensörü ile donatılmıştır. Hücresel ya da izole mitokondriyal süspansiyonlar respirometredeki sürekli karıştırılır. mitokondriyal kompleks aktivitesi için mitokondriyal fonksiyon, alt tabakaların ve inhibitörlerin değerlendirmek için standart protokoller izlenerek eklenebilir. Alt tabakaların ve inhibitörlerin enjeksiyon int ile titre edilebilirOksigraf odaları ve oksijen tüketimi oranları o yazılımı kullanılarak hesaplanır ve hücrelerin sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Solunum artan hassasiyet ve sağlam veya permeabilize hücrelerin biyolojik numunelerin az sayıda çalışma yeteneği de dahil olmak üzere, geleneksel ve konvansiyonel polarografik oksijen elektrod cihazlar fazla birkaç avantaj sunar. Buna ek olarak, her bir cihaz iki odayı içeriyor ve solunum hızları, oksijen konsantrasyonlarının karşılaştırmalar için eş zamanlı olarak kaydedilebilir. yüksek çözünürlüklü Oksigraf geleneksel polarografik oksijen elektrod cihazlara kıyasla aygıt odalardan oksijen azalma sızıntı avantajı vardır. Son zamanlarda hücresel oksijen tüketimini ölçmek için geliştirilen başka bir aygıt 96-iyi hücre dışı akı analiz 5'tir. Hücre dışı akı analizörü yerine polarografik sensörler floresan ile donatılmıştır. hücre dışı avantajlarıyüksek çözünürlüklü Oksigraf I olan) bu ii) 24 ve yüksek verimli tarama için 96-yuvalı plakalar içinde oksijen tüketimini ölçmek mümkündür, büyük ölçüde otomatik bir cihaz ile karşılaştırıldığında akış Analiz Cihazı, Bu nedenle, biyolojik numunelerin düşük miktarda gerektiren ve iii) hücresel glikolitik akı ilave ölçüm mümkündür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf kıyasla dışı akı analizörü dezavantajları) cihazın ve olmayan tekrar kullanılabilir floresan plakalar gibi sarf yüksek maliyetler i, ve ii) tahlil başına sadece dört bileşikler / kuyu enjektabl vardır için, sistem Alt tabaka uncoupler inhibitörü titrasyon protokolleri için uygun değildir.
Bu çalışmada, biz mitokondriyal solunum belirlemek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanın. Hücresel oksijen tüketimi deneyler için hücreler complexe elektronları beslenmesi için eksojen ADP ve okside mitokondriyal substratların girişine izin permeabilizeSolunum sistemi s. Bu yaklaşım, (çok yüzeye hücre geçirgenliği olmayan olan) olduğu gibi hücrelere kıyasla belirgin bir avantajı bireysel mitokondriyal kompleksleri solunum kapasitelerinin diseksiyon sağlar. Ancak, hücre zarı permeabilization dışı ortam ile dengelenir sitozol ve hücre dışı alan ve orta (sitozolik çözünenlerin dışarı yıkama) ve hücre içi alan kompozisyonu arasındaki engeli bozacak. sağlam hücreler üzerinde permeabilize hücrelerin dezavantajlarından biri, deterjan aşırı miktarda hücre geçirgenliği esnasında kullanılan halinde mitokondriyal dış membran hasar olabilir. sağlam hücrelerde bazal, sağlam hücreler birleştirildi ve bağlanmamış solunum ölçülebilir. Bu yöntem, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen ve aynı zamanda maksimal mitokondriyal elektron transpo hakkında bilgi veren, eksojen substratları ve ADP ilavesi olmadan sağlam hücrelerin oksijen tüketimini değerlendirirrt kapasitesi 6, 7. permeabilize hücrelerin içinde sağlam hücreler avantajlarından biri, hücre ortamında bozulmaz ve mitokondri hücrelerin bütün bileşenleri ile temas halinde olmasıdır. Hücresel plazma membran geçirgenliği için, bu tür digitonin deterjanlar 8 kullanılmıştır. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. permeabilize hücrelerin bozulmamış olduğunu mitokondriyal dış membran bütünlüğünü doğrulamak için digitonin titrasyon hücre geçirgenliği için optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için hücreler solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve digitonin konsantrasyonu ölçülür mitokondriyal substratları ve ADP ve solunum oranları varlığında Respirometrik titre edilir. sağlam olmayan permeabilize hücrelerin solunum mitocho mevcudiyetinde stimule değildirndrial yüzeyler ve ADP. Bununla birlikte, daha sonra adım adım digitonin titrasyonu plazma zarlarının kademeli geçirgenliği üretebilecektir ve optimal digitonin konsantrasyonu elde edilir. Bu, tam permeabilization solunum up artış gösterilmiştir. Mitokondriyal kalite ve dış membran bütünlüğü eksojen sitokrom c 2, 9 eklenerek kontrol edilebilir. Sitokrom c mitokondrial elektron taşıma zinciri 10, 11, 12, 12 kDa elektron taşıyan proteindir. Bu mitokondriyal arası boşluğa lokalize olur, ve kompleks IV karmaşık III elektron taşıyan, oksijen tüketimi yer almaktadır. mitokondrial dış membran zarar görmüşse, sitokrom-c serbest bırakılır ve mitokondriyal oksijen tüketimi azalır. Eksojen sitokrom c eklenmesi üzerine, mitokondriyal solunum herhangi büyütme bir göstergesidirmitokondriyal dış membran bozulur.
Permeabilize hücreler, yüzeyler ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri çeşitli protokolleri 3, 9, aşağıdaki eklendi edilir. mitokondriyal kompleks tahrik solunum oranları araştırmak amacıyla, örneğin, aşağıdaki protokol kullanılabilir. hücre geçirgenleştirmeden sonra birinci kompleks I solunum zinciri için alt-tabaka olarak NADH üretir ve sonra ADP ATP (durum 3, aktif bir dönüşüm için ilave kompleks I'in aktivasyonunu tahrik substratlar malat ve glutamat ile uyarılır kompleks I-bağımlı solunum). Bir sabit sinyal ulaşıldıktan sonra, rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) Rotenone FADH 2 süksinat ardından kompleks I. inhibe ettiği ve kompleks II (State 3, aktif bir kompleks II bağımlı solunum) aktif hale getirmek için tatbik edilmektedir. Karmaşık IV-bağımlı solunum, ilk kompleks III ölçmek içinbağımlı solunum antimisin (mitokondriyal kompleks III inhibitörü) eklenerek engellendi. Daha sonra kompleks IV bağlı solunum askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) uygulanması ile uyarılır. TMPD dolayısıyla maksimal kompleksi IV bağımlı solunum hızı (Durum 3) önce ve sodyum azid, mitokondriyal kompleks IV inhibitörünün eklenmesinden sonra solunum oranları çıkarılmasıyla hesaplanır, solunum tamponu otomatik oksitleyebilir. solunum deneyleri, bir kontrol (uyarılmamış hücreler) olarak hizmet eden paralel birinde Oksigraf iki odası, diğer ihtiva eden uyarılmış hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bunların oksijen tüketimi Oksigraf odası içinde ölçülmeden önce Açıkçası, hücreler, mitokondriyal fonksiyonlarını etkileyen ilaçlarla, örneğin, çeşitli şekillerde, önceden işleme tabi tutulabilir. Bu protokol, bireysel mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri fonksiyonel muayene izin verir. Buna ek olarak, tek bir maksimum ADP-uyarımlı ölçebilirsolunum palmitat şeklinde eksojen yağ asit kullanılarak permeabilize hücrelerin (devlet 3). (: 1 mol oranında palmitat: BSA 6) Bu protokol, sodyum palmitat konsantre edildi stokları derece yağlı asit içermeyen sığır serumu albümini (BSA) ile konjüge edilir. Bundan sonra birinci Digitonin ve mitokondriyal solunum ile permeabilize hücrelerin karnitin eklenmesi ile değerlendirilir ve ADP (durum 3, maksimum solunum) ilave edildi palmitat. Ardından, oligomycin durumu 4 (devlet 4o) ve solunum kontrol oranı (RCR değeri) taklit ilave edilir devlet 3 / devlet 4o olarak hesaplanmıştır. β-oksidasyon elektron transfer flavoprotein ve β-hidroksiaçil-KoA dehidrogenaz tarafından elektron taşıma zinciri geçirilen elektronlar olan FADH 2 ve NADH, bir (TCA döngüsünde girer) asetil CoA üretimini ve üretimi teşvik. Mitokondri palmitat-BSA protokolü yağ inceleyerek araştırmacılar tarafından kullanılabilir yağlı asit metabolizmasının merkezinde ve tarif edilenty asit oksidasyonu. Sağlam hücreler, aktivatörleri ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri farklı bir protokole 6, 9, aşağıdaki ilave edilir. Bu deneyler için, eksojen alt-tabakaların yokluğunda olmayan permeabilize hücrelerin birinci oksijen tüketimi (solunum oranı fosforile) ile ölçülür. Daha sonra, sigara fosforile solunum hızı mitokondriyal ATP sentazının bir inhibitörü olan oligomycin eklenmesi sonra ölçülür. Daha sonra, protonophore karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) çeşitli konsantrasyonlarda yönetilmektedir ve maksimal mitokondriyal uncoupled solunum hızı ölçülür. Böyle FCCP olarak Protonophores kemiosmotik degrade dağıtmak için protonların pasif hareket etmesine izin verir iç zarı proton geçirgenliğinin bir büyütme neden olabilir. Proton geçirgenlik artışı oksidatif solunum (ATP üretimi) birbirinden ayrılacak ve o da bir artışa neden olurxygen tüketimi. Daha sonra, rotenon ve antimisin mitokondriyal solunum inhibe etmek için ilave edilir ve olmayan mitokondriyal solunum diğer solunum hızları çıkarılır.
Oksijen tüketim oranları (kapalı oksijen odasında) hacim özel oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı), JV, O şeklinde ifade edilebilir 2 [pmol X sn-1 X mi -1] hücre konsantrasyonu hücre odası içinde (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre ∙ mi 1]) 15. Hücre başına kütle bölü hücre-kütle özel oksijen akı, JO 2 [pmol x saniye -1 x mg -1], hücre başına akışı, IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre], [mg ∙ 10 6 hücre]; veya hacim özgü akı, JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1], vol başına kütle bölüume [mg ∙ mi 1]. JO 2 hücre proteininin, kuru ağırlık veya hücre hacmi başına oksijen akıdır.
yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak bu çalışmada, biz, iii) mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri eksojen sitokrom c kullanarak) I tam hücresel plazma zarı geçirgenliği için optimum digitonin konsantrasyonu (digitonin titrasyon deneyi), ii) mitokondrial dış membran bütünlüğü i belirlemek için protokoller tarif eksojen ADP ve mitokondriyal solunum zinciri alt tabakalar ve mevcudiyetinde Digitonin permeabilize HepG2 hücrelerinde II ve IV maksimum solunum oranları IV) bazal, eksojen alt-tabakaların eklenmeden bağlı olan ve sağlam hücreler maksimum bağlanmamış solunumu (maksimum elektron taşıma kapasitesi) ve ADP, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokolün amacı mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron taşıma sistemi kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ölçmek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanımı idi.
Mevcut protokolde içinde bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, selüler oksijen tüketim oranları genellikle hücrelerin sayısı normalize edilir (pmol / [hücre sn x sayıda]). Bu nedenle, hücre oksijen tüketimi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant nº 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochimie. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).
