Высокое разрешение респирометрии для оценки митохондриальной функции в проницаемыми и неповрежденных клеток

Summary

С высокой разрешающей способностью респирометрии используется для определения митохондриальной потребления кислорода. Это простой метод для определения дыхательной цепи митохондрий комплексов "(I-IV) частота дыхания, максимальная емкость системы митохондриального транспорта электронов, и целостности митохондриальной наружной мембраны.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Митохондрии выполняют важную роль в клеточном метаболизме энергии, особенно при использовании кислорода для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Они причастны к гибели клеток, так и в нескольких заболеваний человека. Митохондриальной окислительного фосфорилирования (OXPHOS) сочетает в себе перенос электронов вдоль цепи переноса электронов с потреблением кислорода и синтеза АТФ. Митохондриальной кислота (ТСА) цикл трикарбоновых участвует в превращении белков, углеводов и жиров в энергию богатых соединений в качестве никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и флавинадениндинуклеотид (FADH _2). Электроны NADH и FADH ₂ затем переносятся в дыхательной цепи переноса электронов белковых комплексов (I до IV) , расположенный во внутренней митохондриальной мембране. Кроме того, два других окислительно-восстановительные пути могут передавать электроны на электрон-транспортной цепи: I) митохондриальной электрон-передачи флавопротеида (ETF), который расположен на матричной поверхности внутренней Mitochondrial мембраны, и поставляет электроны из жирных кислот, бета-окисления; и б) митохондриальной глицерофосфатдегидразы который окисляет глицерофосфат к дигидроксиацетонфосфат и питает электроны в митохондриальной цепи переноса электронов. Комплекс IV (конечная акцептор электронов) переносит электроны в одну молекулу кислорода, превращение кислорода в двух молекул воды. Перемещение электронов из цепи переноса электронов комплекса органов дыхания I к IV связан с потоком протонов из митохондриального матрикса в межмембранное пространство, которое устанавливает электрохимический градиент во внутренней мембране митохондрий. Затем, митохондриальный комплекс V (АТФ-синтазы) челноки ионы водорода обратно в митохондриях и синтезирует молекулы АТФ. Функция OXPHOS может быть оценена в естественных условиях и в пробирке с использованием различных методов и различных митохондриальных состояния дыхания могут быть получены. В изолированных митохондрий следующие respiratoRy состояния могут быть измерены: I) базальный митохондриального дыхания (состояние 1), II) потребления кислорода после добавления специфических субстратов митохондриальных цепных комплексов дыхательных (состояние 2), III) максимальное митохондриальной потребления кислорода после добавления насыщающих концентраций аденозин дифосфат (АДФ) (состояние 3) и, IV) отдыхает дыхания после АДФ потребления (в пересчете на АТФ) (состояние 4). В интактных клетках следующие респираторные состояния могут быть измерены: I) базальный клеточный потребление кислорода в присутствии эндогенных субстратов и АДФ, II) базальный клеточный потребление кислорода в присутствии олигомицином (олигомицином нечувствительные дыхания) и олигомицином-чувствительного дыхания (АТФ оборот), III) FCCP отцеплен дыхание, и IV), не митохондриального дыхания после добавления антимицину а и ротенону. В пермеабилизированных клетках, могут быть добавлены специфические субстраты цепи переноса электронов комплексов и АДФ и максимально комплексных зависящих от интенсивности дыхания сУч, как комплекс I-, II- и IV-зависимые частота дыхания может быть измерено.

Измерения клеточного дыхания дают важную информацию о митохондриальной дыхательной способности , характерные для комплексов I-IV, митохондриальная целостности и энергетического метаболизма ^{1, 2, 3.} Одно из устройств , которые позволяют измерять митохондриальной потребления кислорода с высокой степенью точности, разрешающей способности и чувствительности является высокой разрешающей способностью oxygraph ^4. Устройство с высокой разрешающей способностью oxygraph содержит две камеры с инжекционных отверстий и каждая камера снабжена полярографическому кислородным датчиком. Клеточные или изолированные митохондриальной суспензии при непрерывном перемешивании в респирометре. Для оценки митохондриальной функции, субстраты и ингибиторы для митохондриальной сложной деятельности могут быть добавлены в соответствии со стандартными протоколами. Субстраты и ингибиторы могут быть титруют литьевым Intо палатах oxygraph и нормы потребления кислорода рассчитываются с использованием программного обеспечения и выражается как пикомолей в секунду на число элементов. Высокое разрешение респирометрии имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными и обычными электродных устройств полярографическая кислорода, включая повышенную чувствительность и способность работать с небольшим количеством биологических образцов, таких как нетронутых или проницаемыми клеток. Кроме того, каждое устройство содержит две камеры, и частота дыхания могут быть записаны одновременно для сравнения концентраций кислорода. С высокой разрешающей способностью oxygraph также имеет преимущество уменьшенной утечки кислорода из камер устройства по сравнению с традиционными полярографических кислородного электрода устройств. Другое устройство , в последнее время разработаны для измерения клеточного потребления кислорода является 96-луночного внеклеточный анализатор потока ^5. Внеклеточный анализатор потока снабжен флюоресценции вместо полярографических датчиков. Преимущества внеклеточномфлюс анализатор по сравнению с высокой разрешающей способностью oxygraph являются I), то в значительной степени автоматизировано устройство, II) можно измерить потребление кислорода в 24- и 96-луночные планшеты для высокопроизводительного скрининга, поэтому требуют меньшего количества биологических образцов, и III) дополнительное измерение клеточного гликолитического потока возможно. К недостаткам внеклеточной анализатора потока по сравнению с высокой разрешающей способностью oxygraph являются I) высокая стоимость устройства и расходных материалов, таких как флуоресцентные пластины, которые не являются многоразовые, и II) только четыре соединения в анализе / лунку являются инъекционный , поэтому система не представляется возможным для протоколов титрования субстрат-разобщитель-ингибитор.

В настоящем исследовании мы используем высокого разрешения респирометрии для определения митохондриального дыхания. Для клеточных экспериментов потребления кислорода, клетки проницаемыми, чтобы позволить проникновение экзогенного АДФ и окисляющихся митохондриальных субстратов для подачи электронов в Complexeс дыхательной системы. Такой подход позволяет рассечение отдельных митохондриальных комплексов дыхательных возможностей, что является явным преимуществом по сравнению с интактными клетками (многие субстраты клеточного impermeant). Тем не менее, клеточная мембрана пермеабилизации нарушит барьер между цитозоле и внеклеточное пространство и среду (вымывать из цитозольных растворенные вещества), и состав внутриклеточное пространство уравновешивают внеклеточную среду. Одним из недостатков проницаемыми клеток над неповрежденных клеток является то, что митохондриальная внешняя мембрана может быть повреждена, если чрезмерное количество моющего средства используются во время клеточного пермеабилизации. В интактных клетках, базальный, в сочетании и отсоединяется дыхание интактных клеток могут быть измерены. Этот метод оценивает потребление кислорода интактных клеток без добавления экзогенных субстратов и АДФ, воспроизводя дыхательную функцию в интегрированной камере, а также предоставление информации о максимальном митохондриального электронного TRANSPORT емкость ^{6, 7.} Одним из преимуществ интактных клеток более проницаемыми клеток является то, что клеточная среда не будет нарушена, и митохондрии находятся в контакте с целыми компонентами клеток. Для того , чтобы проницаемыми мембраны клеточной плазмы, детергенты , такие как дигитонина использовались ^8. Тем не менее, митохондриальная целостность внешней мембраны может быть поставлена ​​под угрозу, если чрезмерное количество дигитонином заняты. Для того, чтобы подтвердить, что митохондриальная целостность внешней мембраны не подвергается риску в пермеабилизированных клетках, дигитониновый титрование проводится для определения оптимальной концентрации для клеточной проницаемости. Для этих экспериментов, клетки ресуспендировали в среде дыхания и дигитониновый концентрации титруют респирометрии в присутствии митохондриальных субстратов и АДФ, а также скоростей дыхания измеряются. Дыхательный неповрежденных, непермеабилизированных клетки не стимулировали в присутствии mitochondrial субстратов и АДФ. Однако последующее ступенчатое дигитониновый титрование дало бы постепенное пермеабилизации плазменных мембран, и получается оптимальная концентрация дигитониновый. Об этом свидетельствует увеличение дыхания вплоть до полной проницаемости. Митохондриальная качество и целостность внешней мембраны может быть проверена путем добавления экзогенного цитохрома с ^{2, 9.} Цитохром с представляет собой 12 кДа белка , переносящего электрон митохондриальной цепи переноса электронов ^{10, 11, 12.} Она локализована в митохондриальной межмембранном пространстве, а также участвует в потреблении кислорода, несущий электроны из комплекса III в комплексе IV. После того, как митохондриальной наружной мембраны повреждена, цитохром с отпускается, и митохондриальную потребление кислорода снижается. При добавлении экзогенного цитохрома С, любое увеличение в митохондриального дыхания свидетельствует онарушается митохондриальную наружную мембрану.

В проницаемыми клеток, субстратов и ингибиторов митохондриального комплекса активности добавляются следующие различные протоколы ^{3, 9.} Например, для того, чтобы исследовать митохондриальные сложных управляемых частоту дыхания, следующий протокол может быть использован. После того, как пермеабилизации клеток, первый комплекс я стимулируется малат и глутамат субстратов, которые генерируют NADH в качестве субстрата в дыхательной цепи и провоцируют активацию комплексного I. Затем АДФ добавляют для превращения в АТФ (состояние 3, активный комплекс I-зависимый дыхание). После того, как будет достигнут стабильный сигнал, ротенон (митохондриальный комплекс I ингибитор) вводят для ингибирования сложного I. Ротенон сопровождается сукцинат к FADH ₂ и для активации сложного II (состояние 3, активный комплекс II-зависимого дыхания). Для измерения сложного IV-зависимого дыхания, первый комплекс III-зависимая дыхание подавляется добавлением антимицина А (митохондриальная ингибитор комплекс III). Затем комплекс IV-зависимого дыхания стимулируется путем введения аскорбата и tetramethylphenylendiamine (ТМФД). TMPD может автоматически окисляется в буфере дыхания, поэтому максимальный комплекс IV-зависимой частоты дыхания (состояние 3) вычисляется путем вычитания скорости дыхания до и после добавления азида натрия, ингибитор митохондриальной сложного IV. Эксперименты дыхания можно проводить в двух камерах с oxygraph параллельно-один, выступающей в качестве контроля (стимулированных клеток), других содержащих стимулированных клеток. Очевидно, что клетки могут быть предварительно обработаны различными способами, например, с препаратами , влияющими на митохондриальные функции, прежде чем их потребление кислорода измеряется в oxygraph камере. Этот протокол позволяет функциональное обследование отдельных митохондриальных цепных комплексов дыхательных. Кроме того, можно измерить максимальную АДФ-стимулированнойдыхание (состояние 3) проницаемыми клеток, с использованием экзогенного жирной кислоты в виде пальмитата. В этом протоколе, концентрированные запасы пальмитат натрия сопрягаются с ультра жирных кислот свободным бычьего сывороточного альбумина (БСА) (6: 1 мольном соотношении пальмитат: БСА). После этого клетки в первую очередь являются проницаемыми дигитонином и митохондриального дыхания оценивается путем добавления карнитина и пальмитат с последующим добавлением АДФ (состояние 3, максимальное дыхание). Затем олигомицином добавляют, чтобы имитировать состояние 4 (состояние 4o) и дыхательный коэффициент (значение RCR) рассчитывается как состояния 3 / состояния 4o. β-окисления способствует производству ацетил – КоА (который входит в цикл TCA) и поколение FADH ₂ и NADH, электроны из которых передается в цепи переноса электронов с помощью электронно-передачи флавопротеида и β-hydroxyacyl-СоА – дегидрогеназы. Митохондрии находятся в центре метаболизма жирных кислот и описан протокол пальмитат-БСА могут быть использованы исследователями, исследующих жирти кислоты окисление. В интактных клетках, активаторы и ингибиторы митохондриальной сложной деятельности добавляются следующие другой протокол ^{6, 9.} Для этих экспериментов, первый потребление кислорода непермеабилизированных клеток в отсутствие экзогенных субстратов измеряется (фосфорилирования частоты дыхания). Затем, частота дыхания, не фосфорилирующие измеряют после добавления олигомицином, который является ингибитором митохондриального АТФ-синтазы. После этого протонофор карбонилцианид р-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) администрируется при различных концентрациях и измеряется максимальная митохондриальной отцеплен частота дыхания. Протонофоров, такие как FCCP может индуцировать увеличение протонной проницаемости внутренней мембраны, позволяя пассивное движение протонов, чтобы рассеивать хемиосмотической градиент. Увеличение проницаемости протонов разобщает окислительное дыхание (без производства АТФ) и вызывает увеличение Oxygen потребление. Впоследствии, ротенон и антимицина А добавлены ингибировать дыхание митохондрий, и не митохондриального дыхания вычитается из всех других респираторных ставок.

Скорости потребления кислорода может быть выражено как IO ₂ [пмоль х с ^-1 · 10 ^-6 клеток] (кислород потока на миллион клеток) , который рассчитывается путем деления объема конкретного потока кислорода (в замкнутой кислородной камере), СП, O ₂ [пмоль х сек ^-1 х мл ^-1] концентрацией клеток в клеточной камере (количество клеток на единицу объема [10 ⁶ клеток ∙ мл ^{1]) 15.} Клеточная масса удельный поток кислорода, JO ₂ [пмоль х сек ^-1 х мг ^-1], является расход на одну ячейку, IO ₂ [пмоль х с ^-1 · 10 ^-6 клеток], разделенных по массе на одну клетку [мг ∙ 10 ⁶ ячеек]; или объем конкретного потока, СП, O ₂ [пмоль х сек ^-1 х мл ^-1], разделенная по массе в тумэ [мг ∙ мл ^1]. JO ₂ представляет поток кислорода на клеточного белка, сухого веса или объема клеток.

В настоящем исследовании с использованием высокого разрешения респирометрии, мы описываем протоколы для определения I) концентрации оптимальная дигитониновых для полной клеточных мембран плазмы пермеабилизации (дигитониновый титрование анализа), II) митохондриальной целостности наружной мембраны с использованием экзогенного цитохрома С, III) дыхательной цепи митохондрий комплексы I , максимальные частота дыхания II и IV в дигитониновых-проницаемыми HepG2 клетках в присутствии экзогенного АДФ и митохондриальных субстратов дыхательной цепи, и IV) базальный, в сочетании и максимальное отцеплен дыхание (максимальный перенос электронов емкость) интактных клеток без добавления экзогенных субстратов и АДФ, воспроизводя дыхательную функцию в интегрированной клетке.

Protocol

1. Культура клеток Культура гепатомы человека HepG2 клетки 6 в 25 см 2 для культивирования клеток колбах в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) , содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 ° С в и…

Representative Results

Определение оптимальной концентрации дигитониновых для клетчатого пермеабилизирующего: дигитониновых Эксперимент титрования Дигитониновых титрование проводится для определения оптимальной концентрации для проницаемости клеток He…

Discussion

Цель настоящего протокола заключается в использовании высокого разрешения респирометрии для измерения митохондриальной дыхательной цепи комплексы '(I-IV) частота дыхания, максимальная емкость митохондриального транспорта электронов и целостности митохондриальной наружной мембра…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical