نشر على نطاق صغير iPSCs الإنسان في الظروف المصل خالية لتوصيف Immunocytochemical الروتينية
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
إعادة برمجة الخلايا الجسدية الكبار الإنسان إلى خلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) يوفر وسيلة للحصول على العرض قد يكون غير محدود من خلايا المريض محددة لدراسة مرض 1، 2. سوف تلخص النمط الظاهري المرض في المختبر جعل من المعقول لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المرتبطة مع المرض، وتعزيز اكتشاف الأدوية والطب الشخصي 3. وبالإضافة إلى ذلك، iPSCs الإنسان (hiPSCs) توفر إمكانية استنباط أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها بوصفها موردا فريدا لتحل محل الخلايا الميتة أو مختلة واستعادة وظيفة في سياق العديد من الاضطرابات 4، 5.
شرط هام لاستخدام iPSCs في التطبيقات المذكورة أعلاه هو ضمان أن يتم الحفاظ المحفزة وغير متمايزة دولتهم خلال التوسع في الثقافة. عادة، techniqUES مثل التدفق الخلوي، النشاف الغربي، تفاعل البلمرة المتسلسل والمقايسات الفنية، والتي تتطلب كميات كبيرة من الخلايا والمعدات المتخصصة، وتستخدم لتحليل مفصل لIPSC تعدد القدرات 6، 7، 8، 9، 10. ومع ذلك، يمكن تحقيق التقييم الروتيني للحالة غير متمايزة في iPSCs بشكل فعال من خلال نشر محدود من هذه الخلايا على وجه التحديد لمناعية (ICC)، وبالتالي تنطوي على تخفيض الوقت والموارد.
التطورات الحديثة تسمح لنمو iPSCs في ظروف خالية من المصل محددة، وهو تحسن كبير على أنظمة الثقافة التقليدية التي تتطلب الفئران طبقات الخلايا الليفية التغذية وسائل الإعلام مصل يحتوي على. ومع ذلك، فإن الدراسات الحالية لا تتضمن البروتوكولات تدريجي واضحة تصف كيفية الانتقال iPSCs من وحدة التغذيةطبقة لأنظمة خالية المغذية.
في هذا السياق، فإن البروتوكول تفاصيل منهجي كيف hiPSCs نمت على الماوس المشع الليفية الجنينية (iMEF) طبقات المغذية يمكن أن يكون (1) تكييفها لنشر في المصل خالية المتوسطة، و (2) مثقف على نطاق صغير لدعم تحديدا قوية تحليل immunocytochemical. وعموما، تمثل هذه المنهجية إجراء في الوقت المناسب وفعالة من حيث التكلفة لنشر iPSCs الإنسان في ظروف خالية من المصل لتأكيد تعدد القدرات على أساس روتيني باستخدام مناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول منهجية المعروضة هنا يقدم للوقت وطريقة فعالة من حيث التكلفة، في شكل تقنية ثقافة تحجيم، والمصممة خصيصا لدعم تحليل تعدد القدرات الفعالة عبر مناعية.
المزايا الرئيسية للمنهجية وصفها على النحو التالي. وهناك حاجة عادة أكثر من…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
