Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
Reprogrammierung adulter menschlicher Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS – Zellen) bietet eine Möglichkeit , eine potenziell unbegrenzte Versorgung von Patienten-spezifischen Zellen zu erhalten , zu studieren Krankheit 1, 2. Eine Krankheits – Phänotyp in vitro zusammenfassend würde es 3 mit der Krankheit assoziiert zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen und Wirkstoffforschung verbessern und personalisierte Medizin plausibel machen. Darüber hinaus bieten die menschliche iPS – Zellen (hiPSCs) die Möglichkeit , bestimmte Zelltypen ableiten , die als einzigartige Ressource verwendet werden kann , tot oder dysfunktionalen Zellen und Restore – Funktion im Rahmen von mehreren Störungen 4, 5 zu ersetzen.
Eine wichtige Voraussetzung iPSCs in den oben genannten Anwendungen verwendet wird, um sicherzustellen, dass ihre pluripotenten und undifferenzierten Zustand während der Expansion in Kultur gehalten wird. Typischerweise techniques wie Durchflußzytometrie, Western Blotting, Polymerasekettenreaktion und funktionellen Assays, die große Mengen an Zellen und Spezialausrüstung erforderlich ist , werden für die detaillierte Analyse der iPSC Pluripotenz 6, 7, 8, 9, 10 verwendet wird . Allerdings Routine Beurteilung der undifferenzierten Zustand "iPS-Zellen könnte wirksam durch die begrenzte Vermehrung dieser Zellen speziell für Immunzytochemie (ICC) erreicht werden, somit reduziert Zeit und Ressourcen beteiligt sind.
Jüngste Fortschritte ermöglichen das Wachstum von iPSCs in definiertem serumfreien Bedingungen, was eine erhebliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Kultursystemen, die murine Fibroblasten-Feeder-Schichten und serumhaltigen Medien erfordern. Allerdings ist die aktuelle Literatur nicht klar schrittweise Protokolle umfassen, die beschreiben, wie iPSCs von der Zufuhr für den ÜbergangSchicht Feeder freie Systeme.
In diesem Zusammenhang detailliert die vorliegende Protokoll systematisch wie hiPSCs auf bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (Imef) Schichten sein Feeder gewachsen können (1), der in Serum-freiem Medium zu verbreiten, und (2) kultiviert auf einem kleinen speziell robust zu unterstützen immunzytochemische Analyse. Insgesamt stellt diese Methode eine zeit- und kostengünstiges Verfahren für den menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen ausbreitende für ihre Pluripotenz auf einer Routinebasis bestätigt Immunzytochemie verwendet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die systematische Protokoll präsentiert hier bietet eine zeitsparendes und kostengünstiges Verfahren, in Form einer abgespeckte Kulturtechnik, die speziell zur Unterstützung der wirksamen Pluripotenz Analyse über Immunzytochemie gestaltet.
Die Hauptvorteile der beschriebenen Methode sind wie folgt. Traditionell mehr als 3 bis 4 Durchgänge benötigt iPSCs von Feeder – Schichten , um den Übergang zu Feeder freien Kulturbedingungen, um Rest iMEFs , die nach der Verwendung von Bulk – Disso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
