Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
Riprogrammazione delle cellule somatiche adulte umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) fornisce un modo per ottenere un approvvigionamento potenzialmente illimitata di cellule specifiche del paziente per studiare la malattia 1, 2. Ricapitolando un fenotipo malattia in vitro renderebbe plausibile per esaminare i meccanismi cellulari e molecolari associate alla malattia, e migliorare la scoperta di nuovi farmaci e la medicina personalizzata 3. Inoltre, iPSCs umane (hiPSCs) offrono la possibilità di derivare specifici tipi cellulari che possono essere utilizzati come una risorsa unica per sostituire le cellule morte o disfunzionali e funzione di ripristino nel contesto di diversi disturbi 4, 5.
Un importante prerequisito per utilizzare iPSCs nelle applicazioni di cui sopra è garantire che il loro pluripotenti e indifferenziato stato viene mantenuto durante l'espansione in coltura. Tipicamente, techniques come citofluorimetria, Western blotting, PCR e saggi funzionali, che richiedono grandi quantità di cellule e attrezzature specializzate, vengono utilizzati per l'analisi dettagliata dei COPSI pluripotency 6, 7, 8, 9, 10. Tuttavia, la valutazione di routine di stato indifferenziato delle iPSCs 'potrebbe effettivamente essere raggiunto attraverso la propagazione limitata di queste cellule specificamente per immunocitochimica (ICC), coinvolgendo così tempo e risorse ridotte.
I recenti progressi permettono la crescita di iPSCs in condizioni prive di siero definiti, che è un miglioramento significativo rispetto ai sistemi di coltura convenzionali che richiedono murine strati di alimentazione fibroblasti e mezzi di siero contenente. Tuttavia, la letteratura attuale non include i protocolli graduali chiare che descrivono come la transizione da iPSCs alimentatorelivello per sistemi privi di alimentazione.
In questo contesto, la presente protocollo dettagli sistematicamente come hiPSCs coltivati topo irradiati fibroblasti embrionali (Imef) strati di alimentazione possono essere (1) atto a propagare in terreno privo di siero, e (2) coltivate su piccola scala per supportare specificamente robusta analisi immunocitochimica. Nel complesso, questa metodologia rappresenta una procedura tempestiva e conveniente per la propagazione iPSCs umani in condizioni di assenza di siero per la conferma della loro pluripotenza su una base di routine utilizzando immunocitochimica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sistematica qui presentata offre un risparmio di tempo e metodo conveniente, sotto forma di una tecnica di coltura in scala ridotta, appositamente progettato per supportare efficace analisi pluripotenza tramite immunocitochimica.
I principali vantaggi del metodo descritto sono i seguenti. Tradizionalmente più di 3 o 4 passaggi sono necessari per la transizione iPSCs da strati di alimentazione per alimentatore-Free condizioni di coltura per eliminare iMEFs residui rimanenti dop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
