Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
La reprogramación de células somáticas adultas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ofrece una manera de obtener un suministro potencialmente ilimitado de células específicos para cada paciente para estudiar la enfermedad 1, 2. Recapitulando un fenotipo de la enfermedad in vitro sería plausible para examinar los mecanismos celulares y moleculares asociados con la enfermedad, y mejorar el descubrimiento de fármacos y la medicina 3 personalizado. Además, iPSCs humanos (hiPSCs) ofrecen la posibilidad de derivar los tipos de células específicas que se pueden usar como un recurso único para reemplazar las células muertas o disfuncionales y restaurar la función en el contexto de varios trastornos 4, 5.
Un requisito previo importante para el uso de células iPS en las aplicaciones anteriores es asegurarse de que su pluripotentes e indiferenciada estado se mantiene durante la expansión de la cultura. Típicamente, techniqUES tales como citometría de flujo, transferencia Western, reacción en cadena de la polimerasa y ensayos funcionales, que requieren grandes cantidades de células y equipo especializado, se utilizan para el análisis detallado de IPSC pluripotencia 6, 7, 8, 9, 10. Sin embargo, la evaluación de rutina del estado indiferenciado de las células iPS 'efectivamente podría lograrse a través de la propagación limitada de estas células específicamente para inmunocitoquímica (CPI), lo que implica una reducción del tiempo y los recursos.
Los avances recientes permiten el crecimiento de iPSCs en condiciones libres de suero definidos, que es una mejora significativa sobre los sistemas de cultivo convencionales que requieren capas alimentadoras de fibroblastos murinos y medio de suero que contiene. Sin embargo, la literatura actual no incluye protocolos claros que describen paso a paso cómo hacer la transición a partir de células iPS alimentadorcapa a sistemas libres de alimentador.
En este contexto, el presente protocolo detalla sistemáticamente cómo hiPSCs cultivados en ratón irradiado de fibroblastos embrionarios (IMEF) capas de alimentación pueden ser (1) adaptado para propagar en un medio libre de suero, y (2) se cultivaron en una pequeña escala para apoyar específicamente robusta inmuno análisis. En general, esta metodología representa un procedimiento oportuno y rentable para la propagación de iPSCs humanos en condiciones libres de suero para la confirmación de su pluripotencia de forma rutinaria usando inmunocitoquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo sistemático que aquí se presenta ofrece un ahorro de tiempo y un método rentable, en forma de una técnica de cultivo a escala reducida, diseñado específicamente para apoyar el análisis de pluripotencia efectiva mediante inmunocitoquímica.
Las principales ventajas de la metodología descrita son los siguientes. Tradicionalmente se necesitan más de 3 a 4 pasos a la transición iPSCs de capas de alimentación al alimentador libres de condiciones de cultivo con el fin de el…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
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