Summary
Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).
Abstract
Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.
Introduction
La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína 1, 2. Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas 3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía 4. Estos métodos son mucho tiempo, deben ser alterados para cada proteína diana, y a menudo resultan en bajos rendimientos. Métodos de purificación modernos implican la fusión de etiquetas peptídicas a proteínas diana, seguido por inmunoprecipitación o extracción en columnas cargadas con perlas unidas a una molécula de captura 5,"> 6. Si bien esto es extensible a muchas proteínas, se requiere modificación de la secuencia de la diana, potencialmente resultando en construcciones que difieren en afinidad por sus parejas de unión habituales. La delicada naturaleza de algunas interacciones proteína-proteína significa este método puede no ser aplicable a muchos escenarios. Además, las pull-down ensayos usados para mapear las interacciones proteína-proteína pueden no capturar una imagen precisa celular, debido a los grados de libertad restringidos y los niveles no nativos de la proteína cebo.
Idealmente, los complejos de proteínas podrían ser detectados en sus estados nativos, sin la necesidad de purificación o pull-down. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) se desarrolló como una alternativa menos desnaturalizante a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y permite la separación de algunas proteínas y complejos de muestras biológicas 7. Sin embargo, las proteínas en BN-PAGE separado basado en un larnúmero ge de variables, incluyendo el tamaño, carga, estructura tridimensional, y la asociación con otras moléculas. Las interacciones de estos factores a menudo resultan en co-separación de proteínas, la formación de agregados, y una pobre resolución banda de proteína. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de dos dimensiones resuelve algunos, pero no todos, de estos problemas 8.
Para evitar las complicaciones asociadas con la separación nativa, algunos autores utilizan reactivos de amina reactiva de reticulación, tales como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar complejos de proteínas en lisados de tejido 4. Estos lisados tratados a continuación, se pueden desnaturalizar y se separaron por SDS-PAGE, mientras que preserva el tamaño nativo y maquillaje de complejos de proteínas. Sin embargo, ya que los reactivos de reticulación reaccionan basa en la proximidad de una molécula a otra, y las proteínas en los lisados de tejido tienen muchos grados de libertad y estocásticamente puede interactuar, cruz fondo no específica-linking puede ser alto, especialmente en muestras concentradas. Esto puede conducir a resultados difíciles de interpretar.
Aquí, demostramos el uso de un método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominado electroforesis en gel de poliacrilamida-multímero (multímero-PAGE), para separar y detectar los conjuntos de proteínas en mezclas complejas. Inicialmente, lisado de células se suspende en gel de poliacrilamida a través de BN-PAGE. El gel que contiene lisado se hace reaccionar luego con el DSP reactivo de reticulación. Pseudo-inmovilizado y ligeramente separadas en el gel, las proteínas son mucho menos propensos a reaccionar de manera no específica, lo que significa reactividad fondo reticulante se reduce. Después de la reticulación, las bandas de gel se extirpan y se separó a través de SDS-PAGE. El gel resultante se puede analizar entonces por cualquier medio típicamente asociados con electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método permite la separación y la detección de complejos de proteínas nativas en lisado de tejido sin modificar, sin la necesidad de purificación adicional o pull-downorte.
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Protocol
1. Preparación del tejido
- Preparar 10 ml de 4x tampón de muestra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
NOTA: Esta solución madre se puede hacer de antemano y se almacena a 4 ° C. - Diluir 250! L de tampón de muestra 4x en 750! L dH 2 O que contiene 1x cóctel inhibidor de proteasa comercial. Vortex y se enfría en hielo.
- Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el 1 ml de 1x de hielo frío tampón de muestra BN-PAGE con 30 golpes de un homogeneizador Dounce limpio.
NOTA: Para este experimento de demostración, el tejido diana es toda tejido cerebral de rata. Después de la homogeneización, las muestras pueden ser tratadas con detergente suave como el 2% de digitonina para solubilizar y permitir la electroforesis de proteínas de membrana. - Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se centrifuga a 14.000 xg durante 30 min para sedimentar contenidos celulares insolubles. faetr centrifugación, se decanta el sobrenadante en un tubo limpio en hielo.
- Siga las instrucciones del fabricante para medir la concentración de proteínas sobrenadante utilizando ácido bicinconínico (BCA) o ensayo de cuantificación de proteínas similar.
- Si la muestra (s) de homogeneizado contiene detergente, añadir una cantidad de 5% de azul de Coomassie G-250 en solución acuosa suficiente para llevar la solución homogeneizado a 0,25% Coomassie.
2. BN-PAGE
- Diluir 25 ml de 20x nativo azul (BN) Tampón de electroforesis de stock (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) en 475 ml dH 2 O que contiene 0,002% de azul de Coomassie para hacer 500 ml de tampón de ejecución 1x.
- Si las muestras contienen detergente, en lugar de hacer 250 ml de tampón de ejecución 1x que contiene 0,02% de Coomassie y otros 250 ml que contienen ninguno.
- tampón (s) Chill a 4 ° C.
- Limpiar y montar un gel de poliacrilamida verter casete de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Después de que los geles han polimerizado, enjuague el casete con dH 2 O y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Retire el peine bien y llenar los pocillos con 1 x tampón de ejecución BN-PAGE. Evitar llenar toda la cámara interior con tampón hasta que las muestras se cargan.
- Si las muestras contienen detergente, llenar los pocillos con el tampón que contiene 0,02% de azul de Coomassie.
NOTA: Realice los pasos 2.7 a 2.9 a 4 ° C.
- Si las muestras contienen detergente, llenar los pocillos con el tampón que contiene 0,02% de azul de Coomassie.
- Utilizando puntas de carga de gel, una pipeta un volumen de homogeneizado que contiene 20 g de proteína en los pocillos deseados. Pipeta de un volumen equivalente de tampón de muestra 1x BN-PAGE en cualquier pocillos no utilizados.
NOTA: Utilice la concentración de proteína determinada a partir del ensayo de BCA para calcular el volumen apropiado de homogeneizado para añadir alos pozos. - Después las muestras se cargan, llenar la cámara interior con tampón 1x BN-PAGE en marcha. Asegúrese de que el gel se sumergió por completo en tampón. A continuación, llenar la cámara exterior con tampón 1x funcionamiento hasta el nivel indicado por el fabricante.
- Si las muestras contienen detergente, llenar la cámara interior con el tampón 1x que contiene 0,02% de azul de Coomassie, y la cámara exterior con tampón de ejecución 1x libre de tinte.
- Conectar los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las proteínas en el gel a 150 V hasta que la banda colorante avanza ~ 2 cm en la solución de capa. Parar y desconectar la fuente de alimentación.
3. El entrecruzamiento
NOTA: Realice los pasos 3.1 a 3.6 a 4 ° C.
- Desmontar el aparato de electroforesis, y separar los cristales del casete de gel. Retirar y desechar la capa de apilamiento.
- Corte cuidadosamente el gel justo por debajo del borde inferior de la frente de colorante. Tomarcuidado para hacer este corte tan lisa y recta posible, y luego desechar la pieza no utilizada de gel. Esto dejará una ~ 2 cm de ancho, franja horizontal de gel de poliacrilamida, que contendrá toda la proteína en la muestra de homogeneizado.
- Recorte las porciones no utilizadas a lo largo de los bordes de la tira de gel.
- Con cuidado, coloque la tira en 10 ml solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un pequeño recipiente, y mezclar suavemente por nutación durante 30 min para equilibrar.
- Después de la equilibración, desechar y sustituir el PBS con otros 10 mL. Pipetear 500 l de 25 mM DSP disolvió en sulfóxido de dimetilo en la PBS, y continuar mezclando como anteriormente (etapa 3.4) durante 30 min.
- Retirar la solución DSP. Añadir 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), pH 8,8, que contienen 2% de dodecilsulfato sódico (SDS) para extinguir el DSP sin reaccionar. Continuar nutación durante 15 min.
4. SDS-PAGE
- Mientras tira de gel se temple, preparar SDS-PASoluciones de gel de GE acuerdo con métodos estándar 9. No añadir reactivos de polimerización.
- Después de inactivar, devuelva la tira de gel ΒΝ a temperatura ambiente, y emitir la tira en una nueva casete de gel.
- Para ello, recoger cuidadosamente el gel y colocarlo en una placa espaciadora casete de gel limpia.
- Orient la tira por lo que la parte inferior de la frente de colorante es la más cercana a la parte superior de nuevo casete (es decir, el lado que viajó más lejos durante BN-página debe estar más cerca de la parte superior de la nueva casete; la tira de gel debe ser volteado de su previa orientación). Véase la Figura 3.
- Coloque la tira de tal manera que su borde superior se encuentra incluso con el lugar donde va a ser el borde superior de la placa de cubierta (es decir, será en la parte superior de la nueva gel). Asegúrese de que el frente de colorante es paralela a los bordes horizontales de la placa de vidrio.
- Empuje un lado de la tira extirpado contra una de las paredes del espaciador, dejando espacio en tél otro lado para gel para ser vertido y un estándar de proteína o escalera para ser cargado.
- Si el borde inferior de la tira de gel contiene ningún zonas poco uniformes, corte con cuidado a la basura. Si está presente, se atrapar burbujas durante gel vertido.
- Una vez que la tira de gel se coloca correctamente, coloque la placa de cubierta sobre la placa espaciadora. Aplique una leve presión para expulsar las burbujas de aire atrapadas.
- Continuar para montar el aparato de gel-vertido de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir los reactivos de polimerización para el tampón de gel de resolución, y se vierte en el casete de gel preparado, usando una pipeta serológica. Llenar el casete de gel a ~ 2 cm por debajo de la tira de gel BN-PAGE extirpado, para dejar espacio para el apilamiento de capas.
- Añadir 100! L butanol sobre la parte superior del gel se vierte, y permitir que 30 min para la polimerización de la capa de la solución. Retirar el butanol.
- Añadir los reactivos de polimerización para la solución de gel de apilado. El uso de un serologpipeta ical, se vierte la capa de apilamiento para llenar todo el espacio vacío que queda en el casete de gel.
- Incline la casete de gel como la capa de apilamiento se vierte de modo que llene el espacio por debajo de la tira de gel, y las burbujas de aire no están atrapados.
- A medida que el tampón de gel de apilamiento llena el espacio vacío debajo de la tira de gel, gradualmente devolver el casete de gel a pie de nivel.
- Continuar para llenar el espacio vacío al lado de la tira de gel escindido con el tampón de gel de apilamiento, hasta que casi se desborda.
- Permitir que la capa de apilamiento polimerizar durante 30 min.
NOTA: Hacer 10x SDS-PAGE tampón de ejecución (tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (TRIS), 1,9 M de glicina, 1% SDS), mientras que el gel se polimeriza. Esto también se puede hacer de antemano y se almacena a temperatura ambiente. - Diluir 50 ml de 10X tampón de SDS-PAGE corriente Stock en 450 ml dH 2 O para hacer tampón de trabajo 1x.
- Después de la capa de apilamiento ha polimerizado, retire la casete de gel de la coladaaparato, enjuague con dH 2 O, y montar el aparato de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Llenar la cámara interior completamente con tampón de ejecución SDS-PAGE 1x, a continuación, llenar la cámara exterior hasta el nivel indicado por el fabricante.
- Cargar el espacio al lado de la tira de gel escindido con una escalera de peso molecular o patrón de proteína apropiada.
- Coloque los electrodos a la fuente de alimentación, y a electroforesis las muestras a 120 V. Cuando el colorante Coomassie se sale de la gel, parar y desconectar la fuente de alimentación.
- Analizar el gel usando métodos estándar de electrotransferencia y detección de proteínas mediante la unión 10 de anticuerpo.
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Representative Results
En este experimento de demostración, multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata. Las proteínas resultantes separados se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), y después se sondaron con anticuerpos contra las proteínas que se sabe que forman complejos. La figura 1 muestra una validación del protocolo por dos medios. En primer lugar, se demuestra que las proteínas reticuladas son escindibles mediante la adición de un agente reductor, es decir, las especies de mayor peso molecular observadas están formados por el reactivo de reticulación, y no se deben a cualquier otro componente del protocolo (Figura 1A) . En segundo lugar, se demuestra que la reticulación es sensible a la adición de detergentes (Figura 1B), lo que significa la reticulación es específica a las proteínas complejadas y que la reactividad al azar debido a la proximidad en el gel se reduce al mínimo. La Figura 2 demuestra que el método no logra captar respiratory complejo II, pero por lo demás tiene una amplia aplicabilidad para la captura de los dos complejos solubles y unidas a la membrana.
Figura 1: Validación de método multímero-página. (A) Captura de complejos de proteínas por in-gel reticulación con DSP es sensible a la escisión por dithiothretol (DTT). Multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata sin (A1) o con (A2) 5 mM dithiothretol incluido en la solución de enfriamiento Tris / SDS. El gel se sometió a electrotransferencia sobre membranas de PVDF, y luego probaron para la cadena pesada de quinesina. Una banda de alto peso molecular se observó en ambas membranas, probablemente correspondiente a la totalidad o parte del complejo proteína motora quinesina. Hay una banda adicional que se produzca en 126 kDa en la mancha tratada con TDT, la masa molecular del péptido de cadena pesada de quinesina. Ditiotreitol es un agente reductor, y es capaz de revertir cross-linking por escisión del enlace disulfuro presente en DSP. El agregado kinesin tanto, es sensible a la escisión por la TDT. (B) La proteína de captura de complejo es sensible a la adición de detergentes desnaturalizantes. Multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata como se describe en el texto, excepto cantidades crecientes (0 a 2%) de SDS (izquierda) o Triton X-100 (a la derecha) se añadieron a las muestras de lisado, y luego se incubaron en hielo durante 30 min antes de cargar la primera gel. Los geles finales se transfirieron a membranas de PVDF y se sondaron para α-sinucleína. se observó al menos tres bandas de aumentar el peso molecular, correspondiente a la? -sinucleína monómero, tetrámero, y octámero, respectivamente. Las intensidades de señal de las bandas oligoméricos disminuyen al aumentar la concentración de detergente, lo que indica que la reticulación eficacia es dependiente de conformación de la proteína nativa. Haga clic aquí a view una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Demostración de la captura de complejos de proteínas utilizando multímero-página. (A) complejos de proteínas solubles y unidas a la membrana fueron capturadas a partir de (A) de rata completo lisado cerebro o lisado (B) se incubaron con 2% de digitonina durante 1 hora a 4 ° C, mediante la realización de multímero-PAGE como se describe en el texto. Los geles fueron entonces borrados y las membranas de PVDF se sondaron para los componentes de diversos complejos. especies de alto peso molecular se observan en la membrana probaron para la tubulina acetilada, que se conoce para estabilizar microtúbulos. La dineína y kinesin son múltiples subunidades complejos de proteínas motor con pesos moleculares de 1,5 MDa y 380 kDa, respectivamente. Las membranas se atiborra para componentes de estos complejos muestran especies de alto peso molecular. Además, multímero-PAGE al éxito cEl dímero HSP90. La α-sinucleína forma tetrámeros y octameros, así como oligómeros neurotóxicos de alto peso molecular. El octamer y una racha de especies de mayor peso se ven en la membrana manchada. También se observa la dimerización de VDAC. Se detectan especies de alto peso molecular en las membranas transferidas para componentes de los complejos mitocondriales I y IV. Sin embargo, la membrana transferida para SDHA, un miembro del complejo II, no demuestra ninguna banda apropiada de alto peso molecular. AcetTUB: alpha - tubulina acetilada; ΒTUB: β-tubulina; Dineína: cadena pesada de dineína; HSP90: proteína 90 de choque térmico; Kinesina: cadena pesada de kinesina; NDUFS3: centro hierro-azufre 3 del complejo mitocondrial I; VDAC: porin; SDHA: succinato deshidrogenasa del complejo mitocondrial II; COXIV: citocromo C oxidasa del complejo mitocondrial IV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: diagrama de flujo general multímero-página. (A) Preparar lisado de tejido utilizando métodos no desnaturalizantes, tales como la homogeneización en tampón de muestra BN-PAGE. (B) lisado Pipetear en gel BN-PAGE, a continuación, realizar electroforesis (150 voltios) en tampón de funcionamiento BN-PAGE. Permitir que la muestra migre hasta que el frente de colorante ha migrado ~ 2 cm en el gel de resolución. (C) Retire el apilado de las capas y la porción no utilizada de la capa de la solución. (D) Sumergir la tira de gel en PBS, y se equilibre con agitación durante 30 min. (E) Retirar el PBS, y volver a sumergir la tira de gel en PBS que contenía 2,5 mM DSP. Agitar durante 30 min. (F) eliminar la solución de DSP, a continuación, volver a sumergir la tira de gel en Tris 375 mM que contenía 2% de SDS, y agitar durante 30 min. Complejos presentes en la tira de gel están estabilizadas por cross-linking. (G) Girar tira el gel 180 ° y echado en un nuevo gel SDS-PAGE. Incluir tanto el apilamiento y la resolución de las capas. (H) Resolver muestra por electroforesis (120 voltios). (I) Retirar la tira de gel y la capa de apilamiento, a continuación, analizar la solución de capa como sea necesario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad 11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como se demuestra en la Figura 2. En comparación con otros métodos de estudio de complejos de proteínas, multímero páginas es ventajoso debido a su simplicidad y brevedad. El tiempo desde la muestra de tejido para separar completamente SDS gel es de aproximadamente 8 h. Puesto que la detección se puede hacer mediante transferencia occidental típica, el protocolo se puede realizar en lisado de tejido sin modificar, con límites de detección mucho más bajos que los asociados con experimentos desplegables. Además, la mayoría bien equipado labo biología molecularlabo- serán capaces de realizar la técnica con poca inversión inicial. Como se discute más adelante, la mayor parte del reto asociado con multímero-PÁGINA viene con la solución de problemas y la optimización del método para cada complejo de proteína estudiada.
Mientras multímero-PÁGINA debe ser accesible a la mayoría de los biólogos moleculares, su éxito depende de la habilidad y experiencia del investigador. Críticamente, el corte y re-fundición de la tira de gel de BN en el nuevo gel SDS se debe hacer con cuidado. Es importante para orientar la tira de gel de manera que la electroforesis hace que las proteínas para migrar en el gel de SDS en bandas paralelas. Si la tira de gel se echa torcida, las bandas de proteína migrarán una en la otra y se perderán datos. Especialmente para grandes complejos, la rotación de la tira de gel antes de la colada en el gel SDS-PAGE es igualmente importante. Esto da a los complejos más grandes, que pueden no haber migrado muy lejos en el gel BN-PAGE, más tiempo para ser tirado en el Laye resolverr del gel SDS-PAGE. Es importante destacar que los cambios en la proteína de tamaño y las características físicas causadas por reticulación también deben considerarse durante el análisis. Por ejemplo, algunas proteínas de bajo peso molecular, tales como α-sinucleína, no están bien retenidos en las membranas de PVDF, pero sus oligómeros reticulados son 12. Esto puede confundir el análisis comparativo, y debe ser tenido en cuenta.
Cuando la separación de un complejo por multímero-página para la primera vez, es importante para validar el método. Sugerimos tres pruebas de validación / solución de problemas. En primer lugar, asegurarse de que el péptido de interés migra en el gel BN siguiendo el protocolo multímero-PAGE hasta la escisión de la tira de gel, y luego se detiene, secar la tira sobre una membrana de PVDF, y la sonda para la subunidad de interés. Si no hay señal, el complejo probablemente no migrar en el gel BN, lo que significa que debe hacerse más poroso, o la muestra se debe permitir que migrar más en el resolvcapa ing. La presencia de una señal confirma que la subunidad al menos no unido migra en el gel. En esta etapa, será difícil confirmar la presencia del complejo completo. Si se detecta la evidencia de la subunidad en la tira de gel BN, pasar a la segunda prueba. Realizar multímero-página sin un paso de reticulación, luego seque a una membrana de PVDF y la sonda para la subunidad. La subunidad debería desnaturalizar en presencia de SDS y migrar normalmente en el gel SDS. Si esto no ocurre, es posible que haya algún problema con la técnica del investigador. La tira de gel BN puede haber sido mal cortado, dejando detrás un poco de proteína, o el gel SDS puede haber sido lanzado de forma incorrecta. Por último, realizar multímero-PAGE con una etapa de escisión reticulante incluido, luego seque y la sonda, como se discute en la Figura 1. Esto confirma la agregación del complejo es debido a la adición de DSP, y no una consecuencia inesperada de alguna otra parte del protocolo multímero-página. La escisión debe dar lugar a una reducirbanda agregado d-intensidad y una banda de monómero subunidad aumento de la intensidad en la imagen. Si ninguna banda agregado se ve desde multímero-PAGE al normal, pero la banda de monómero aumenta en intensidad cuando DSP se escinde, el complejo probablemente ha hecho que sea al gel SDS, pero no pudo migrar en la capa de la solución.
En su estado actual, multímero páginas es aplicable a muchos complejos de proteínas, pero no es una talla única para todos protocolo. Es probable que necesita ser modificada para cada complejo de interés. Un problema común se demuestra en la Figura 2: complejos capturados son a menudo tan grandes que apenas migran sobre SDS-PAGE. Esto puede ser gestionado por el cambio de la porosidad del gel SDS o la realización de la electroforesis durante periodos de tiempo más largos. Una complicación adicional es la presencia ocasional de más de dos bandas en el gel. Reacción incompleta con el reticulante puede resultar en una distribución de bandas de peso molecular intermedio 13. Esto puede hacer que sea difficult para determinar si múltiples bandas son representativos de productos intermedios oligoméricos fisiológicamente importantes, o consecuencias simplemente no intencionadas de la reticulación parcial. Para las proteínas de membrana que se deben solubilizarse antes del análisis, también es importante tener en cuenta el impacto que la elección del detergente tiene en los comportamientos de los complejos de proteínas. El detergente usado para solubilizar proteínas de membrana afecta a sus conformaciones, asociaciones con parejas de unión, y las funciones 14, 15. Choice detergentes también afecta a la eficacia de reticulación de 16. Por lo tanto, es probable que las condiciones de solubilización ideales variarán con el complejo siendo estudiado.
Multímero-PÁGINA ocasionalmente no logra captar un complejo, como se muestra en la transferencia SDHA en la Figura 2. succinato deshidrogenasa es parte de la 124 kDa mitocondrial complejo II, que es lo suficientemente pequeño que debe moverse fácilmente en el gel.Que no se detectó indica que multímero páginas fue incapaz de capturarlo. Casos como estos tienen muchas explicaciones posibles. La mayoría de los reactivos de reticulación contienen dos extremos reactivos, que forman enlaces covalentes con las cadenas laterales de aminoácidos. La eficiencia con la que los reactivos de captura de los complejos de proteínas de reticulación depende de su accesibilidad a los residuos reactivos. En el caso de DSP, la reticulación se lleva a cabo por acilación de grupos amino disolvente expuestos primarias y secundarias alifáticas, por lo general los grupos -amino de la lisina 17. Residuos de lisina se encuentran normalmente en la superficie de la proteína, pero su secuestro ocasional en centros hidrófobos disminuye la eficiencia de la reticulación 13. Las subunidades del complejo II están enterrados en la membrana mitocondrial, y pueden permanecer inaccesible a DSP, incluso después de la solubilización con digitonina 18. complejos muy grandes y densamente-embalaje, tales como oligome amiloideRs, también pueden limitar la disponibilidad de residuos de lisina de superficie a reactivos de reticulación. Como resultado, estos tipos de conjuntos de proteínas pueden no ser compatibles con multimer-PAGE. También es posible que Azul Coomassie, que se une a las regiones hidrofóbicas y residuos catiónicos, se mantiene después de equilibrio en PBS y bloquea la reticulación en algunos casos [ 19] . Esto podría disminuir o eliminar la detección de oligómeros afectados por multimer-PAGE. Por lo tanto, el método no es un ensayo universal para caracterizar todas las asociaciones de proteínas, y no debe considerarse cuando la cuantificación en deseado. Sin embargo, multimer-PAGE es una herramienta económica y relativamente rápida para analizar complejos de proteínas, y puede ser considerada junto con otros medios establecidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Con el apoyo de la DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos a Bryan A. Killinger para la asistencia técnica con el multímero-página.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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