Summary
Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.
Abstract
kas lifi popülasyonlarının miktarının belirlenmesi hastalık, travma ve iskelet kas bileşimine çeşitli diğer etkilerden daha derin bir fikir verir. Çeşitli zaman alıcı yöntemler geleneksel olarak araştırmanın pek çok alanında fiber popülasyonları incelemek için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda tek bir bölümünde birden çok elyaf tiplerini belirlemek için pratik bir alternatif temin miyozin ağır zincir protein ifadesine dayalı immünohistokimyasal yöntemleri geliştirilmiştir. Burada, bütün kesit ve ImageJ fiber popülasyonlarının otomatik ölçümü otomatik olarak alınmasının sağlayan, geliştirilmiş boyama kalitesi için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Bu amaç için, gömülü iskelet kasları hücrelerinin çekirdekleri boyama ikincil floresan antikor ve DAPI ile miyozin ağır zincir antikorlar kullanılarak boyanmış, kesitler kesilir. Tüm çapraz Kesitler daha sonra yüksek çözünürlüklü bir kompozit elde etmek için bir kayar tarayıcı kullanarak otomatik olarak taranırtüm örneğin resimler. Lif nüfus analizleri sonradan ImageJ için otomatik bir makro kullanarak, yavaş, orta ve hızlı lifleri ölçmek için yapılır. Daha önce bu yöntem ±% 4 bir dereceye kadar güvenli bir elyaf popülasyonlarının belirlenmesi göstermiştir. Buna ek olarak, bu yöntem arası kullanıcı değişkenliği ve önemli ölçüde açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak analiz başına süresini azaltır.
Introduction
İskelet kası bileşim, yaşlanma, 1, 2, egzersiz, 3, 4, 5, 6, 7 ya da böyle bir hastalık 8, 9, 10 ya da travma 11 olarak patofizyolojik işlemler gibi fizyolojik süreçlerde önemli değişikliklere uğrar. Dolayısıyla, bu süreçlerin yapısal etkileri konusunda araştırma konsantresi birkaç alanları işlevsel değişiklikleri anlamak için. kas fonksiyonunu belirleyen önemli yönlerinden biri kas liflerinin bileşimdir. Kas lifleri, farklı miyozin ağır zincir (MHC) proteinleri ifade eden ve bu şekilde, 13 yavaş, orta ya da hızlı lifler 7, 12 sınıflandırılır >, 14, 15, 16, 17. Fizyolojik olarak, kaslar vücutta işlev bağlı olarak farklı kas lifi bileşimleri vardır. Kas lifi yazmaya kullanılarak, lif popülasyonları, 17, fizyolojik veya patofizyolojik süreçler 7 uyarlanmasına belirlemek için ölçülebilir. Tarihsel olarak, zaman alıcı bir dizi yöntem kas lifi tipleri arasında ayırt etmek için uygulanmıştır. Bu amaç için, kas lifleri çeşitli pH seviyelerinde veya kas enzim aktivitesinin de myosin ATPase reaktifliğinden olarak sınıflandırıldı. Farklı lif kalitesi tek bir bölümü tespit edilemedi, birden çok enine kesitleri, tüm kas lifleri tespit ve miktar 14, 16, 17 kılavuzu izin vermek için gerekli olduğunu,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Buna karşılık, yeni yayınlar hızla tek kesitlerinde çok liflerini boyamak için miyozin ağır zincir proteine karşı immünohistokimya (IHC) kullanılabilir. Bu prosedürün avantajları dayanarak, şimdi kas lifi nüfus analizi 19, 23, 24 altın standart olarak kabul edilir. geliştirilmiş IHC boyama protokolleri kullanarak, tüm kas kesitleri ve daha sonra otomatik bir kas lifi miktar tam otomatik satın açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak uygulanabilir olduğunu göstermek için yakın zamanda mümkün. Kılavuzu ölçümü ile karşılaştırıldığında, prosedür 4 ±% olurken slayt başına gereken süre (kılavuzun yaklaşık% 10 analizleri) önemli bir azalma sağlanmaktadır 25
Bu yöntemin genel amacı, bir açık kaynak platformu kullanılarak bütün sıçan kaslarda otomatik kas lifi ölçümü için hızlı, güvenilir ve kullanıcıdan bağımsız kılavuzunun tanımlamaktır. Buna ek olarak, özellikle fareler veya insan kas gibi diğer numuneler için kullanılmalarını sağlayan potansiyel değişiklikleri tarif eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FELASA 26 tarafından tavsiye edildiği hayvan deneklerin dahil tüm işlemler laboratuvar hayvanları bakım prensiplerine uygun olarak yürütülmüştür. Onay Viyana Tıp Üniversitesi ve Araştırma ve Bilim Avusturya Bakanlığının kurumsal inceleme kurulu tarafından çalışmanın öncesinde elde edildi (BMWF: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b /: Bundesministerium Wissenschaft und Forschung, referans numarası für 2014).
1. Kas Hasat
NOT: Meng ve arkadaşları tarafından bir önceki yayın. 27 ayrıntılı olarak kas örneklerinin doğru dondurma tarif mevcuttur.
- Hemen hayvanların ötenazi sonra tüm kesitlerini elde etmek tüm kasları veya yeterli doku elde etmek.
- anestezi veya ötenazi sıçan kadar tüm kas çıkarın. Tüm bağ dokusu ve forseps ve makas ile kas çevreleyen tendonları çıkarın. bir içinnesthesia veya ötenazi, FELASA 28 uluslararası kurallara uyun.
- kalibre edilmiş hassas ölçeğini kullanarak kas tartın. Bu hızlı adım özellikle girişimsel prosedürlerinden sonra, kas numuneleri arasındaki bir analiz sağlar.
- Her taraftan yaklaşık olarak 1 mm bir arayla kas büyüklüğüne göre, OCT bileşiği ile tamamen dolu bir kap içine, kas koyun (örneğin alüminyum folyodan yapılmış).
- Yaklaşık 2 dakika içinde dondurularak sıvı azot kullanılarak izopentan soğutulmuş. izopentan kabın dibinde beyaz kristaller göstermeye başlamalıdır.
Not: Bu adım kasının doğru mimarisi muhafaza etmek için gereklidir ve böylece doğru boyanma sağlar ve fiber 27 analiz eder. - Mağaza numuneler -80 ° C'de en az 24 saat süre ile, OCT içinde muhafaza. Örnekler, ancak, corre, bir kaç ay ya da hatta yıllar boyunca -80 ° C'de saklanabilir ctly soğutulmuştur.
- Bir kriyotom kullanılarak -20 ° C 'de kas orta kısmı 10 um enine kesitler halinde kesilmiştir. 10 um kesilerek uygun değilse, 20 um maksimum 2 um adımlarla kalınlığı artar. Yeterince keskin kesme bıçakları bu adım için çok önemlidir.
- kesitleri slaytları benzetmekle yapışkan slaytlara uygulama bölümlerinden. kesitleri otomatik yapışkan slaytlar sadık olacaktır. gece boyunca boyama önce -20 ° C 'de slaytlar saklayın.
2. Boyama
NOT: miyozin ağır zincir proteinlere karşı antikorların büyük bir kısmı mevcuttur; Ancak, kaliteli antikorlar otomatik edinimi ve analizler için gereklidir. Seyreltici ve antikorlar referans için Tablo 1 'e bakınız. Bir tablo dosyası doğru seyreltme hesaplamak ve gerekli çözüm miktarlarda sayısını görmek için, bkz1 File source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental.
- Çözülme ve boyama prosedürü, 10 dakika süreyle dondurulmuş kas bölümleri, hava-kurutun.
- Yıkama fosfat tamponlu tuz (PBS) +% 0.05 Triton X 10 dakika süre ile ve daha sonra 5 dakika süre ile dikkatli bir şekilde kayar. Triton önemli boyama kalitesini artırmak için gösterilmiştir. Daha fazla detay için açıklamalara bakın.
- 2 dakika boyunca bölümler hava kuru olsun ve (antikor gerekli miktarda en aza indirmek için) ve 15 dakika için ek kurutmaya olanak sağlayan, bir hidrofobik kalem kullanılarak her lamın tek tek kesitlere özetlemektedir.
- PBS + Tüm slaytlar bloke% 0.05 Triton X (PBST), oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 10 keçi serumu ihtiva eden.
- PBS +% 0.05 Triton X (PBST) içeren% 10 keçi serumu bir karışım içinde tüm birincil antikorlar (Tablo 1) seyreltin. Uygulama öncesinde yeterince karıştırın. Triton X bütün enine kesitlerinin eşit boyanması için esastır. Hesaplamakkesiti başına birincil antikor kokteylinin yaklaşık 30 uL.
- adımlar 2,7-2,13 için ışıktan yeterli korunma sağlamaktadır. Sönük oda ışıkları ve kapalı boyama tepsileri yeterli koruma sağlar. Buna ek olarak, boyama sırasında nemli bir ortam sağlar ve kurumasını önlemek için alt kısımdaki sıvı ile boyama tepsi doldurun.
- Oda sıcaklığında bir nemli boyama tepsisine 1 saat slaytlara birincil antikor (Tablo 1) kokteyller uygulanır.
- 5 dakika için yeni PBST ile daha sonra da 10 dakika süre ile PBS +% 0.05 Triton X slaytlar yıkayın.
- PBS +% 0.05 Triton X (PBST) +% 10 keçi serumu bir kokteyli ikincil antikorlar seyreltilir. kesiti başına birincil antikor kokteylinin 30 uL hesaplayın.
- 1 saat boyunca slaytlara ikincil antikor kokteyli uygulanır.
- PBS ile slaytlar yıkayın +% 0.05 Triton X 10 dakika ve 5 dakika daha yeni PBST (PBST).
- DAPI nükleer boyama kiti (tercihen okuma kullanımlı çözeltiler) fo uygular, 15 dakika ya da hücre çekirdekleri leke üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir.
- Yıkama kısaca PBS + slaytlar% 0.05 Triton X 1 dakika için (PBST). Daha sonra, slaytlar hava kuru kısaca bildirin.
- Floresan montaj orta ve lamelleri uygulayın. 4 ° C'de ışıktan korunmuş ve 24-48 saat içinde en iyi şekilde görüntüleme gerçekleştirmek.
3. Mikroskopi
- Yük slayt tarayıcıya kayar. 12 slaytlar maksimum slayt tarayıcı bağlı mümkündür.
- Yeni bir proje başlatın. Önizleme için DAPI kanalı ve 2.5X lensi ayarlayın. Ayrıntılı analiz için DAPI, GFP, FITC ve Cy5 kanalları ve 20X objektif kullanın. Otomatik odaklama DAPI kanalında proje boyunca elde edilir.
- DAPI -blue FITC: yeşil, Teksas Kırmızı: Kırmızı, Cy5: Sarı her kanal için aşağıdaki renkler kullanın.
- DAPI kanalı kullanılarak her lamın önizleme oluşturun. Bu amaçla, ilk numune üzerinde manuel odaklamayı uygulamak ve önizleme boyunca kullanmayıAnaliz her numunenin önizleme resimlerini elde etmek.
- Ayrıntılı edinim süreci için eklenmesi gereken her kesiti Anahat. bütün ilgilendiren alanın başlığını sağlamak için, numunenin kenarlarına yakın özetliyor çekmeyin.
- Her bir kanal için maruz kalma sürelerini ayarlar. Çoğu durumda, farklı kanalların pozlama parametreler tüm kesitler için aynıdır.
- Otomatik görüntü elde etme çalıştırın. Erken otomatik süreçte yanlış edinimi önlemek için, görüş ilk alan için doğru edinimi edin.
- Gerekirse, masaüstü yansıtma yazılımını kullanarak uzaktan kontrol kurmak. Bu, herhangi bir ağ veya internet bağlantısı üzerinden farklı bir bilgisayara slayt tarayıcının bilgisayar ekranı yansıtma görüntü elde etme sürecinin uzaktan izlenmesine olanak sağlar. Hiçbir değişiklik kullanılan slaytlar ilişkin fiziksel kurulumu yapılabilir rağmen, görüntü elde etme yazılımı sanal ortam izleme verir Görüntülerin doğru odak veya pozlama süreleri. Buna ek olarak, tamamlanması için tahmini süre düzenli olarak kontrol edilebilir.
- Görüntü edinimi işleminin tamamlanmasından sonra, elyaf mimarisi, tek tek liflerin ve çeşitli lif türleri ayırt edilebilir el ile kontrol edilerek tüm görüntülerin doğru otomatik odak kontrol eder.
- Yeniden edinilen yanlış görünümü veya ilgi tüm alanların tek alanlar için görüntü alanlarını duruldu. Tek alanların yeniden kazanımı için, tüm proje boyunca alanları veya görüntüleri işaretlemek ve manuel odaklama sahip alanları reacquire. Çoğu durumda, farklı bir odak seviyesinde ilave bir görüntü ayrıntısı yanlış odaklı görüntülere yol açar
- Nihai analizlere dahil edilmesi gereken her kesit için, jpeg dosyaları olarak ayrı ayrı (DAPI hariç) her kanalı ihracat. Ad ve Texas Kırmızı, FITC ve Cy5 adlı klasörlerde maruz kanallara göre dosyaları sıralamak.
4. Otomatik Elyaf Analizi
çadır "> Not: Makro aşağıdaki web sayfasından elde edilebilir: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- Önizleme analizler yapılmadan önce, geleneksel bir Görüntü düzenleme yazılımı ve lekeli elyaf ve arka arasında yeterli kontrast kontrol her resim. Gerekirse, parlaklık ve kontrast ayarı komutları kullanarak, farkı artırmak için kontrast ve parlaklık ayarı.
- Açık ImageJ veya Fiji. komutunu kullanarak makro aç "- Makrolar - Eklentiler. Edit" Bu makro kaynak kodunu gösterir ve parametrelerin hızlı adaptasyon sağlar. Gerekirse, makro kaynak kodunda her kanal için klasör dizinini değiştirin.
NOT: kas lifi analizler için Değerler sıçan biceps ve lumbrikal kasların, diğer türler veya farklı değerler gerektirebilir kaslarda dayanmaktadır. - makro başlatmak için "run" komutunu kullanın. klasörün tüm resimler artık makro yüklenen ve bir ardışık sırayla ölçülür. Sonuçlar sho vardırYeni bir pencerede wn. Bu adım, veriler analiz edilen miktarına bağlı olarak, birkaç saat saniye sürebilir.
- Bir elektronik tablo dosyası olarak sonuçları penceresini aktarın. (Yavaş) pozitif sayılmıştır Cy5 için (ara ürün) FITC ve Texas Kırmızı (hızlı) lifleri değerleri belirlemek ve toplam lif sayısı için Özetle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm fare kas kesitleri, MHC I, IIA ve IIB'nin kas lifleri tespit etmek immünohistokimya kullanılarak hızlı bir şekilde boyanmıştır. Bir floresan mikroskop lamı tarayıcı kullanarak, tüm kesitler daha sonra otomatik olarak otomatik kas lifi amacıyla elde edilen ImageJ ile analiz eder. usul kavramı kas liflerinin miktarının belirlenmesi için basit, güvenilir ve zaman tasarrufu sağlayan bir iş akışı sağlayan dayanır.
Daha önce Meng ve arkadaşları, önceki bir öğretici anlatılan prosedür iş akışı (Şekil 1), kas numuneleri doğru kaldırma ve donma ile başlar. 27. Bu yeterli boyama kalitesi için önemlidir. Bir sonraki adımda, kas örnekleri miyozin ağır zincir proteinleri sınıf I, IIA ve IIB ve uygun ikincil floresan antikorlar karşı birincil antikorlar kullanılarak kesilmiş ve boyanır. Optimal st içinkalite Tahliye, ikincil antikorlar için üreticinin tavsiye edilen konsantrasyonlarda iki katına ve Triton X daha boyama kalitesini temin etmek üzere bir antikor kokteyller için de kullanılır. kas liflerinin immunofluorescent boyama minör çapraz reaksiyon ile hızlı ve bizim kurulumunda en fazla 26 slaytlar grupları için yaklaşık 5 saat içinde gerçekleştirilebilir. Elde edilen görüntüler pozitif elyaflar ve etraftaki doku ve farklı lif türleri arasında güçlü bir ayrım (Şekil 2) arasında yüksek kontrast gösterdi. Daha sonra, görüntü elde etme, tüm kas kesitleri otomatik tarama izin veren bir slayt tarayıcı kullanılarak gerçekleştirilir. Burada, en fazla 12 slaytlar gecede, örneğin, otomatik olarak taranır. Bu sayede, enine kesitlerin genel görüntüler tek bir elyaf morfolojisinde (Şekil 2) denetlenmesine izin veren bir çözünürlük ile yüksek ayrıntılı olarak oluşturulur.
Son aşamada, bireysel kanallar of her kesit ImageJ için özel olarak tasarlanmış bir makro kullanılarak kas lifi popülasyonlarının ölçümü için ihraç edilmektedir. Kılavuzu analizler, yaklaşık 60 dakika 25 aldı ise otomatik analiz, 3.000-6.000 lifler arasında ihtiva eden bir sıçan biseps kesiti için yaklaşık 5-10 dakika sürer. Otomatik analizler iş istasyonu ve dosya boyutu hesap gücü kuvvetle bağlıdır. Daha önce gösterildiği gibi, makro kılavuzu analizi (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında ±% 4 hassasiyetle nispi kas lifi popülasyonları tespit edebilmektedir. Genel olarak mutlak sayımlar daha önce gösterildiği gibi, ancak, görece önemli olan bir ±% 4 aralığında benzer kaldı analizleri kılavuzuna oranla daha yüksektir.
Şekil 1: kas lif miktarının belirlenmesi Protokolü iş akışı. İlk olarak, kas örnekleri elde edilirHayvan ve dondurulmuş doğru (Meng ve ark. 27 ile jove video). Sonra kas kesitleri kesmek ve bağışıklık lekelenmesi yürütmek. Ayrıntılı bütün kesitler görüntüler için bir slayt tarayıcı kullanarak lekeli kesitleri görüntülerini elde edin. kas lifi nüfus analizleri için ImageJ için sayısallaşan makro çalıştırın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Sıçan biceps kas Kesit. Lekeli bir sıçan biseps kas kesitinin Genel Bakış: kesit kırmızı, yeşil ve hızlı MHC IIB liflerde sarı ara MHC IIA elyaf yavaş MHC I lifler gösterir. Daha büyük Versi görmek için buraya tıklayınBu rakam üzerine.
Şekil 3: Kas Elyaf Şekil kas MHC I 2. Analizleri MHC IIA ve MHC IIB liflerinin Sıçan Kesit Analiz Sonuçları. Üst: manuel veya otomatik sayım kas liflerinin Mutlak sayar. Orta: Manuel ölçümü sonrasında kas lifleri popülasyonlarının parçasına göre değerlendirmek. Alt: mutlak miktar sonrası kas lifleri popülasyonlarının parçasına göre değerlendirmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: MHC Liflerin immünohistokimyasal Boyama. s için kullanılan seyreltiler da dahil olmak üzere birincil ve ikincil antikorlar Açıklamasıprosedür taining. (Bergmeister et al den modifiye edilmiştir. 25)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, çalışma ve otomatik olarak bir zaman etkili bir şekilde immünohistokimya ile sıçan kesitlerinin kas lifi popülasyonları ölçmek için yaygın olarak erişilebilir bir yöntem göstermektedir. tekrarlanabilirlik için, adım açıklama ve bu çalışmada açıklanmayan diğer türlerde uygulamalar için potansiyel modifikasyonlarla detaylı adım sunuyoruz. Ayrıca, en iyi işlev ve sınırlamaları için prosedürün avantajları, ön koşulları tartışır.
Şu anda, boyama yöntemlerinin bir takım kas lifi popülasyonlarının belirlenmesi için mevcuttur ve bir dizi yöntem kas lifleri 17 manuel ya da yarı-otomatik ölçümü için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, herhangi bir protokol serbestçe temin edilebilen, her iki birleştirme ve güvenilir kas lifi popülasyonları leke ve otomatik olarak elde edilmesi ve kas lifleri ölçmek için standart bir yaklaşım tarif mevcut yazılım analiz eder. önceki yayınlarda dayanarak"> 24, 29, biz, optimize fare kas kesitleri fiber popülasyonlarının otomatik analizler için miyozin ağır zincir immünohistokimyasal boyama prosedürleri, mevcut. Bu şekilde, kısa bir süre önce, bütün enine kesitlerin otomatik analizi el analizleri ile karşılaştırıldığında, mümkün güvenilir olduğunu gösterdi ve daha fazla zaman tasarrufu 27. Buna ek olarak, yöntem, kullanım bağımsız böylece insan hatasını azaltmak ve böylece farklı tedavi grupları arasında, örneğin bir objektif karşılaştırma sağlanmasıdır.
Bütün protokol otomatik ölçümü işlemi için bütün enkesitlerin detaylı ve yüksek kaliteli görüntüler sunan dayanmaktadır. bir açık kaynak yazılım olarak ImageJ kas lifi tanımlanmasını sağlar makro düzenlenmiş güçlü ama basit komutları, bir dizi sağlar. Bununla birlikte, içinde ya da kesit ihtiyaç arasındaki kalite farklılıkları güvenilir sonuçlar elde etmek için en aza düşürülmesi. Biz teşhis vard gerekli kaliteyi sağlamak için çok önemlidir bazı kritik adımlar. Bu en uygun birincil antikorlar kullanılmasını içerir. Benzer şekilde, farklı flüoresan sinyal sağlayan uygun ikincil antikorların kullanımı gerekli oldu ve gelişmiş bir sinyal kalitesi için konsantrasyonları iki katına çıktı. Buna ek olarak, antikor kokteyl Triton X kullanımı ile daha yüksek ve daha da boyama kalitesini görülmektedir. Önemli olan, bu yerine Tween kullanımı ile gözlenmedi. Suboptimal boyama kalitesi ile Görüntüler manuel otomatik görüntü elde etme izin vermek iyi bir kontrast için ayarlandı. edinim süreci için en önemli otomatik odaklama sisteminin doğru işlev idi. Bu amaçla, otofokus sistemi için güvenilir bir işaretini sağlanan uydu hücreleri, hücre çekirdekleri leke DAPI-kit kullanılır.
ImageJ ölçümü işlemi için, en uygun değerler otomatik sonuçları ve birbirini takip eden ince tu için manuel karşılaştırılmasıyla belirlenmiştirparametrelerinin 25 ning: Eşik ve analiz parçacıklar. Elde edilen değerler, biceps ve lumbrikal kas ve bu nedenle potansiyel olarak başka sıçan kaslar için yeterli olmuştur. Buna ek olarak, Bloemberg ve diğ. 24 boyama, insan veya fare gibi diğer türler için geçerlidir olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, tüm protokol teorik olarak diğer türler kullanılmak üzere adapte edilebilir, ancak, bununla birlikte, gerekli parametreleri belirleme gerektirecektir. İlgili komutlar kaynak kodunda vurgulanır.
Prosedürün Diğer olası modifikasyonlar slayt tarayıcının kurulumunu kapsar. Bizim kurulumda, gerçek edinimi için önizleme ve 20X objektif bir 2.5X mercekle, bir slayt tarayıcı sistemi kullandık. önizleme işlemi için objektif değişen kalite ve hız açısından anlamlı bir fayda sağlayacaktır Oysa alım aynı zamanda hız (ve con artırmak için bir 10X objektif kullanılarak yapılabilirsequently çözünürlük ve sonuç elde etme süresini artırmak için çözünürlüğü) ya da bunun yerine bir 40X objektif azaltın. Çözünürlüğünü artırmak sıçan kaslar için gerekli en olası değildir, ancak diğer türler için kabul edilebilir, Şekil 2'de gösterildiği gibi. Bu kurulum uygun olan diğer modifikasyonlar, MHC-II® elyaf veya kasın hücre dışı matris görselleştirmek için laminin için boyama edilir. Bu değişiklikler, ancak, (örneğin Cy7 için) iki ek reflektörler için alma düzeneği değişen ve ek eklemek için ImageJ makro değiştirerek komut koduna doğru parametrelerle analiz gerektirir.
Bu tekniğin bir sınırlama nispi hücre sayısı bakımından 25 kalmıştır mutlak lif sayısı, bir önceki analiz manuel sayısı ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek olduğu bir. Bu büyük olasılıkla yetersiz ayırma ve elyafların bu şekilde tekrar ölçümü sonucudur. Bu etkiyetersiz lekeli ya da eserler diğer türleri gösteren elyaf daha mevcuttur. Ancak, göreli lif sayısı ve böylece fiber popülasyonları sayısı son derece doğru kalmıştır. Bir enine kesite sahip bir tanımlanmış alt kısmı nicel yaygın bir uygulama, örneğin,% 40 ile karşılaştırıldığında, biz heterojen kas lifi mimari bir sonucu olarak daha doğru olduğunu ImageJ ile bütün enine kesit analizleri inanıyoruz (Şekil 2) . prosedürün bir dezavantaj genel olarak mümkün değildir, tüm enine kesitinin otomatik satın alma için pahalı slayt tarayıcılar, kullanımı gerekliliktir. Alternatif bir yaklaşım görüşlerin tek bir alanını kazanmak ve makro tarafından tek tek her ölçümüdür.
Sonuç olarak, bu protokol yaygın erişilebilir ve bütün kas kesitleri hızlı ve güvenilir ölçümü serbestçe kullanılabilir yazılım analizleri kullanarak verir inanıyoruz. Bu nedenle, tanıtılan prosedürkas lifi morfoloji analizi için yararlı bir katkı sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Christian Doppler Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Proje boyunca destek için Viyana, Avusturya Tıp Üniversitesinde Çekirdek Tesisi Görüntüleme Sabine Rauscher teşekkür etmek istiyorum. İlköğretim antikorlar NIH NICHD yarattığı ve Iowa, Biyoloji Bölümü, Iowa City Üniversitesi'nde muhafaza Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde, Schiaffino, S. tarafından geliştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C.
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J.
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J.
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
