Summary
Cette procédure décrit comment lancer rapidement, étendre et connecter des neurites organisées dans des chambres microfluidiques en utilisant des billes revêtues de poly-D-lysine fixées sur des micropipettes qui guident l'allongement des neurites.
Abstract
Les lésions du cerveau et de la moelle épinière peuvent conduire à un handicap permanent et à la mort car il n'est toujours pas possible de régénérer les neurones sur de longues distances et de les reconnecter avec précision à une cible appropriée. Ici, une procédure est décrite pour lancer rapidement, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Les taux d'extension atteints atteignent plus de 1,2 mm / h, 30 à 60 fois plus vite que les taux in vivo des axones à plus forte croissance du système nerveux périphérique (0,02 à 0,04 mm / h) 28 et 10 fois plus rapides que précédemment signalés pour le même Type neuronal à un stade de développement antérieur 4 . Premièrement, les populations isolées de neurones d'hippocampe de rat sont cultivées pendant 2-3 semaines dans des dispositifs microfluidiques pour positionner précisément les cellules, ce qui permet une micromanipulation facile et une reproductibilité expérimentale. Ensuite, les perles recouvertes de poly-D-lysine (PDL) sont placées sur des neurites pour former un conteneur adhésifLes actes et la micromanipulation par pipette sont utilisés pour déplacer le complexe résultant de neurites-perles. À mesure que le cordon est déplacé, il élimine un nouveau neurite qui peut être étendu sur des centaines de micromètres et connecté fonctionnellement à une cellule cible en moins de 1 h. Ce processus permet une reproductibilité expérimentale et une facilité de manipulation tout en contournant des stratégies chimiques plus lentes pour induire une croissance des neurites. Les mesures préliminaires présentées ici démontrent un taux de croissance neuronal dépassant largement les facteurs physiologiques. La combinaison de ces innovations permet l'établissement précis de réseaux neuronaux en culture avec un degré de contrôle sans précédent. C'est une méthode novatrice qui ouvre la porte à une multitude d'informations et d'informations sur la transmission et la communication du signal dans le réseau neuronal, tout en étant une aire de jeux pour explorer les limites de la croissance neuronale. Les applications et expériences potentielles sont répandues avec des implications directes pour les thérapies qui visent à reconnecter les neuronesL après un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives.
Introduction
Les blessures au système nerveux central adulte (SNC) peuvent entraîner un handicap permanent en raison de mécanismes multiples qui limitent la repousse axonale 1 . Après une blessure, de nombreux axones CNS ne forment pas un nouveau cône de croissance et ne parviennent pas à monter une réponse régénératrice efficace 2 . En outre, les dommages et les tissus cicatriciels entourant les lésions du SNC inhibent de manière significative la croissance axonale 1 , 2 , 3 . Les thérapies actuelles pour favoriser la régénération du SNC après une blessure se sont concentrées sur l'amélioration du potentiel de croissance intrinsèque du neurone blessé et sur le masquage des inhibiteurs de l'extension axonale associée aux débris de myéline et à la cicatrice gliale 1 , 3 . Malgré cela, la capacité de régénérer les axones longs vers des cibles distantes et de former des synapses fonctionnelles appropriées reste sévèrement limitée 4 , 5 , 6 , 7 .
Dans le présent travail, les microbilles, la micromanipulation par pipette et les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour lancer rapidement, allonger et connecter avec précision de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de longues distances. Des travaux antérieurs ont montré que les perles revêtues de poly-D-lysine (PDL-beads) induisent une adhérence membranaire suivie par le regroupement des complexes de vésicules synaptiques et la formation de boutons presynaptiques fonctionnels 8 . Il a également été démontré que lorsque le cordon PDL s'écarte mécaniquement après la différenciation présynaptique, le groupe de protéines synaptiques suit le cordon, en initiant un nouveau neurite 9 . La procédure suivante exploite ce fait avec la capacité de culture des neurones embryonnaires de l'hippocampe de rats dans des régions organisées sur une lamelle en utilisant des dispositifs microfluidiques de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour renvoyer précisément un neuronecircuit.
Ces dispositifs microfluidiques PDMS sont non toxiques, optiquement transparents et se composent de deux chambres connectées par un système de microcanaux. Une fois assemblé sur une lamelle, chaque dispositif sert de moule pour guider la croissance neuronale et maintenir des cultures neuronales saines sur des motifs précis pendant plus de 4 semaines in vitro .
Ici, un cadre est présenté pour étudier les limites d'extension et de fonctionnalité du nouveau neurite. Des neurites nouveaux et fonctionnels sont créés et positionnés de manière à pouvoir (re) câbler des réseaux neuronaux de manière contrôlable. Les taux d'extension atteints sont supérieurs à 20 μm / min par rapport aux distances à l'échelle millimétrique et les connexions fonctionnelles sont établies. Ces résultats montrent, de façon inattendue, que la capacité intrinsèque de ces neurites pour l'allongement est beaucoup plus rapide qu'on ne le pensait auparavant. Cette approche mécanique proposée contourne les stratégies chimiques lentes et permet une connexion contrôlée à une cible spécifique. ThLa technique ouvre de nouvelles avenues pour l'étude in vitro de nouvelles thérapies pour restaurer la connectivité neuronale après une blessure. Il permet également la manipulation et le câblage des réseaux neuronaux pour étudier les aspects fondamentaux du traitement du signal neuronal et de la fonction neuronale in vitro .
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Protocol
Toutes les procédures détaillées ci-dessous ont été approuvées par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et sont conformes aux lignes directrices du Conseil canadien des soins animaux.
1. Normalisation des cultures neuronales à l'aide de dispositifs microfluidiques: assemblage de périphériques
- Sélectionnez un périphérique microfluidique approprié pour l'expérience souhaitée. Pour connecter les neurones au sein d'une même population, utilisez Neuro Devices ( Figure 1 ) et pour connecter les neurones dans différentes populations, utilisez les Dispositifs de Co-Culture ( Figure 6 ).
- Nettoyez et préparez le nombre souhaité de lamelles stériles ou de plats de fond de verre. Pour obtenir de meilleurs résultats sur des surfaces en plastique, utilisez des plats de 35 mm, des verres de 25 mm ou des plats de fond de verre de 35 mm. Sélectionnez l'épaisseur du verre en fonction du système d'imagerie, par exemple 0,15 mm.
- Mettez la vaisselle ou les lamelles avec 0,5 à 1 ml de PDL 100 μg / mL pendant 2 h ou pendant la nuit à température ambianteAture.
Remarque: Le protocole peut être mis en pause ici et reprendre le jour suivant si vous le souhaitez. En outre, les vaisselles peuvent être revêtues de PDL dilué par tampon de borate, de poly-L-lysine (PLL), de laminine ou de toute autre molécule d'adhésion cellulaire. - Laver la vaisselle à deux reprises avec de l'eau (ne pas utiliser de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) car les cristaux de sel peuvent bloquer les canaux), enlever tout le liquide et laisser sécher dans un environnement stérile comme une armoire à biosécurité pendant 5-10 minutes ou jusqu'à La surface est complètement sèche.
Remarque: Veillez à ce que les lamelles soient absolument secs, car tout liquide restant entrainera l'adhérence des systèmes microfluidiques. - Placez des dispositifs microfluidiques avec des motifs orientés vers le haut sous la lumière UV dans un environnement stérile (armoire de sécurité biologique) pendant 10 min. Assurez-vous de suivre les procédures stériles lorsque vous travaillez dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques 10 .
- À l'aide de pincettes, placez un appareil microfluidique avec un motif orienté vers le bas en contact avec la housse propreIp / plat. Utilisez les pinces pour appuyer doucement sur l'appareil afin qu'il adhère au verre.
Remarque: La transparence de la région adhérente sera visible lorsque vous regardez la lumière. Assurez-vous que tous les coins sont en contact avec le verre. Faites ceci pour tous les appareils microfluidiques. Voir la figure 1a . - Pour remplir le dispositif de population unique avec un moyen, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 50 μL de milieu cellulaire complet complété par du B-27 sans sérum (rapport volumique 1:50) et 500 μg / mL de pénicilline / streptomycine / glutamine (collectivement Appelé NBM) au puits supérieur droit, puis ajoute 50 μL supplémentaires au puits en diagonale. Faites ceci pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s'écoule entre les puits. Ensuite, ajouter 50 μL de milieu aux 2 puits restants. Voir la figure 2a .
- Pour compléter le multiple de population avec un moyen, pointez la pipette vers les canaux et ajoutez 30 μLDe NBM complète sur les puits droits, se reporter à la figure 6a . Faites ceci pour tous les appareils, en vous assurant que le fluide s'écoule entre les puits. Ensuite, ajouter 50 μL de milieu aux 4 puits restants.
- Placez les appareils dans une plaque plus grande avec un plat ouvert avec de l'eau autoclavée (chambre humide) et placez-les dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité) pendant 1-2 h tout en préparant la culture cellulaire. Voir la figure 2b .
2. Galvanisation des neurones dans les systèmes microfluidiques
- Suivant le protocole décrit dans la Réf. 8 , obtenir des neurones disjoncteurs hippocampiques ou corticaux à partir d'embryons de rats Sprague Dawley (soit le genre).
- Ressusciter les neurones embryonnaires dans NBM à une concentration de 1 à 2 millions de neurones / mL. Vérifier les concentrations cellulaires au microscope en utilisant un hémocytomètre et après la référence 8 . Ajuster la concentration de cellule en accordG à la densité cellulaire souhaitée. Pour augmenter les chances d'obtenir des axones d'hippocampe individuels par canal, déposez 10 000 neurones par appareil. Pour avoir des axones multiples dans le même canal, déposez 60 000 neurones par périphérique.
Note: Ces nombres varient en fonction du type neuronal utilisé. - Retirez le support des dispositifs microfluidiques sans vidanger les puits. Laissez environ 5 μL dans chacun.
- Pour plaquer les cellules dans le dispositif de population unique, ajoutez 50 μL de NBM dans le puits inférieur droit. À ce stade, le fluide s'écoule lui-même pour remplir l'autre puits inférieur. Ajouter 20 μL de la solution de cellule concentrée dans le puits supérieur droit du dispositif microfluidique, comme indiqué sur la figure 1b .
- Pour les cellules de plaque dans le dispositif de population multiple, ajouter 20 μL de la solution de cellule concentrée dans chacun des puits droits de la figure 6a .
- Vérifier au microscope si les cellulesSont à l'intérieur des chambres et placez les appareils dans l'incubateur pendant 15 à 30 minutes pour favoriser la fixation des cellules sur le substrat.
- Vérifiez au microscope s'il y a suffisamment de cellules dans les chambres. Si d'autres sont nécessaires, répétez les étapes 2.4 et 2.5.
- Ajouter 50 μL de NBM aux 2 puits supérieurs du dispositif de population unique et 20 μL de NBM dans le même endroit que les cellules ont été injectées dans le dispositif de population multiple. Les médias dépassent légèrement pour former un ménisque positif donnant aux puits un aspect muffin top. Encore une fois, voir la figure 2a .
- Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d'humidité.
3. Maintien des cultures neuronales
- Retirez NBM (environ 30 μL avec une pipette) à partir des cellules et appliquez un nouveau NBM préchauffé le jour suivant leur introduction aux appareils (soit 1 heure après l'étape 2).
- Vérifiez tous les 2 jours s'il y a suffisamment de moyen dans chaque voie. Si le muffin tOp est bas, ajoutez simplement plus de puits au puits supérieur.
- Cellules de culture pendant au moins 7 jours avant l'élimination des dispositifs microfluidiques. Les cellules peuvent survivre dans ces dispositifs pendant plusieurs semaines. Retirez les appareils 1-2 jours avant que les expériences ne soient effectuées sur des échantillons.
4. Suppression des dispositifs microfluidiques
- 1 - 2 jours avant l'élimination des dispositifs microfluidiques, ajouter 2 mL de NBM préchauffé à 37 ° C à chaque échantillon de plat, inonder les chambres et maintenir les dispositifs dans l'incubateur.
- Utilisez des pinces stériles et une pointe pour enlever les dispositifs microfluidiques des lamelles en laissant une configuration à motifs des neurones. Utilisez la pointe pour maintenir la lamelle en place et la pincette pour serrer le bord de l'appareil dans le coin inférieur gauche du puits. Appliquer délicatement la torsion, soulever le dispositif avec la pince à épiler afin de retirer la lamelle. Voir la figure 2c - 2d .
- Tous les 2-3 jours, remplacer haSi le NBM jusqu'à ce que l'échantillon soit utilisé pour des expériences.
- Avant d'effectuer des expériences de ré-câblage sur l'échantillon, vérifiez que les neurites dans les canaux de la population unique et les populations neuronales dans le dispositif de population multiple sont isolées en examinant les lacunes entre elles au microscope pour s'assurer qu'il n'y a pas de filaments reliant les populations neuronales.
5. Préparation des perles revêtues de PDL
- Ajouter 2 x 50 μL de gouttes de perles de polystyrène 4, 10 ou 20 μm diluées dans de l'eau (1: 500) à 1 mL de PDL (100 μg / mL). Laissez pendant au moins 2 h à température ambiante.
Remarque: Le protocole peut être interrompu ici et repris le lendemain. - Centrifuger la solution à 8 820 xg pendant 1 min. Retirez soigneusement le surnageant sans perturber les perles accumulées au fond du récipient.
- Laver les billes deux fois avec 1 mL de solution 10 mM HEPES pH 8.4 stérile.
- Remettre en suspension les billes revêtues de PDL dans 200 ml d'HEPES 10 mM pH 8,4Solution.
6. Préparation des micropipettes
- Préparez des pipettes à partir de tubes capillaires en verre (1 mm de diamètre intérieur, 1,5 mm de diamètre extérieur) à l'aide d'un extracteur d'électrode horizontal. Réglez les réglages afin que la pointe externe de la micropipette tirée soit ~ 2-5 μm. Avant de tirer, assurez-vous que les tubes de verre sont propres.
- Fixez les pipettes aux diapositives de verre pour le stockage et assurez-vous que la pointe ne contacte pas la surface de la glissière car la pointe est fragile. Conserver à température ambiante dans un récipient couvert pour protéger contre la poussière. Utilisez les pipettes le même jour où elles sont tirées.
7. Adhésion PDL-perle aux neurones
- Ajouter 40 à 60 μL de billes revêtues de PDL préparées à l'étape 5 à une culture cellulaire préparée à l'étape 4. Centrer la pointe de pipette sur les neurones, qui sont légèrement visibles sur la lamelle, et ajouter les perles (voir la figure 3 ).
- Retourner l'échantillon à l'incubateur pendant 1 h pour favoriser la formation de syContacts naptiques 8 , 9 .
- Après l'incubation, retirer les billes non adhérentes en lavant doucement la culture avec NBM préchauffé.
8. Préparation de la solution saline physiologique (pour les expériences de température ambiante)
- Préparer une solution saline physiologique en combinant les ingrédients énumérés dans les références 7 , 8 . Il s'agit de réguler l'environnement cellulaire en dehors de l'incubateur.
- Vérifier l'osmolarité et les niveaux de pH comme indiqué dans les références 7 , 8 .
- Infléchir continuellement la solution avec O 2 pour minimiser les fluctuations de pH tout en effectuant des expériences.
- Chauffer à température ambiante.
- Mettre en place le système de perfusion en insérant une extrémité d'un tube en plastique (dimensions facultatives) dans une solution physiologique infiltrée par O 2 et en fixant l'autre eNd à une aiguille insérée dans le porte-échantillon. Placez le tube et la solution plus haut que l'échantillon (voir la figure 4 ).
- Débranchez le tube de l'aiguille et connectez-le à une seringue. Utilisez la seringue pour exercer une pression et tirer du liquide, en remplissant le tube. Sceller avec une pince à rouleaux et reconnecter l'aiguille.
9. Micromanipulation de perles
- Installez l'échantillon dans une configuration expérimentale de telle sorte que les cellules puissent être accédées par le haut par deux micropipettes montées dans des micromanipulateurs et accessibles optiquement ci-dessous, par exemple avec l'objectif de phase 40X (ouverture numérique de 0,6) d'un microscope optique inversé. Dans cette configuration, montez une caméra CCD pour la capture d'image sur le port latéral du microscope. Connectez chaque pipette à des seringues de 1 mL via des tubes en plastique. À cette étape, remplacer NBM par une solution saline physiologique (1-2 mL) (voir la figure 4 ).
- Au cours de l'expérience, Perfusionner continuellement des cellules avec la solution saline physiologique préparée à l'étape 8 à une vitesse de 0,5 à 1 ml / min.
- Sélectionnez un PDL-bead non attaché à un neurone dans le champ de vision. Alignez le cordon avec une pointe de micropipette en concentrant sur le cordon puis sur la micropipe. Apportez la pointe le plus près possible du cordon en le surveillant au microscope.
- Appliquer une pression négative avec la seringue de 1 ml connectée à la pipette pour retirer le cordon. Maintenir une pression négative tout au long de l'expérience.
10. Tirant les neurones
- Sélectionnez un tampon PDL attaché à un neurone dans le champ de vision et attachez-le à la deuxième micropipette à l'aide d'une aspiration comme décrit aux étapes 9.3 à 9.4.
- Tirez le complexe PDL-bead-neuron par lentement (~ 0,5 μm / min) en déplaçant le micromanipulateur ou l'échantillon en 1 μm et en pause pendant 5 minutes pour permettre l'initiation des neurites.
- Répétez l'étape 10.2 deux fois.
Note: Les 3 premiers &# 181; m doit être tiré très lentement pour garantir le succès expérimental, qui se produit plus de 95% du temps. - Tirez le complexe PDL-bead-neuron par lentement (~ 0,5 μm / min) en déplaçant le micromanipulateur ou le stade de l'échantillon de 2 μm et en pause pendant 5 minutes pour permettre l'allongement des neurites.
- Après une initiation réussie et une extension des neurites pour les premiers 5 μm, tirez le neurite à 20 μm / min sur des distances à l'échelle millimétrique.
Remarque: Le tirage peut être effectué en continu ou en étapes et à des taux variables. Voir la figure 5b -5c .
11. Raccordement des neurones
- Sélectionnez une région riche en neurites et abaissez le complexe PDL-bead-neurite afin qu'il s'en fasse physiquement. Utilisez d'autres perles pour évaluer la hauteur de la pointe au-dessus de la surface de la lamelle. Voir la figure 5d .
- Laisser le complexe PDL-bead-neurite en contact avec le neurite cible tout en manipulant le deuxième micropiPette. Abaisser la deuxième pipette avec le deuxième tampon PDL sur le nouveau neurite nouvellement formé, environ 20 μm du premier bourrelet. Utilisez le deuxième tampon PDL pour pousser le nouveau filament de neurite vers la cellule cible.
- Tenez les deux perles en place pendant au moins 1 h. Vérifier l'absence de gonflement focal, un épaississement des neurites en contact avec le cordon, au microscope 16 .
- Pendant ce temps, utilisez la perfusion pour changer lentement le milieu de l'échantillon de la solution saline physiologique à la NBM pré-réchauffée et équilibrée de CO 2 .
- Relâchez le cordon de la deuxième pipette en relâchant l'aspiration. Si le nouveau neurite reste attaché, relâchez également le premier cordon. Voir la figure 5e .
- Retirez doucement la solution saline et remplacez-la par NBM (~ 2 mL).
- Remettre soigneusement l'échantillon dans l'incubateur pour renforcer la connexion neuronale pour les expériences futures. Cette connexion est stable pour> 24 h 7
12. Vérification de la fonctionnalité de la nouvelle connexion via des enregistrements de pinces à patchs à puces intégrés
- Suivez les références 7 , 18 , 19 . Pour assembler une installation d'électrophysiologie.
- Suivre les références 7 . Pour préparer les électrodes pré et post-synaptiques.
- Rassembler les données de pince de patch, à nouveau suivant les références 18 , 19 .
- Comparez les résultats avec les signaux naturels 7 pour déterminer le type de connexion.
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Representative Results
Les neurones hippocampiques du rat embryonnaire sont cultivés dans des dispositifs microfluidiques pour permettre un positionnement précis des cellules, des puces PDL et des micromanipulateurs. La première étape consiste à assembler correctement l'appareil microfluidique sur une lamelle ou un plat en verre. Il est essentiel que le dispositif microfluidique soit bien attaché au substrat pour éviter que les cellules quittent les chambres et ne se déplacent sous les parties du dispositif qui doivent être scellées ( figure 1a ). Pour maintenir des cultures saines pendant plusieurs semaines, il est important d'éviter l'évaporation moyenne en vérifiant le milieu cellulaire tous les 2-3 jours et en préservant un ménisque positif de milieu ( Figure 2a ). L'évaporation moyenne est également évitée en gardant à la fois les cellules et un plat d'eau ouvert dans une plaque plus grande ( figure 2b ). Les dispositifs microfluidiques peuvent être enlevés à tout moment. Pour des résultats optimaux, NBM devrait être ajouté à la cellule-deVice au moins 1 jour avant l'enlèvement du périphérique. Cela minimise le stress cellulaire car les neurones sont en contact avec le milieu à la température et au pH idéaux lorsque les dispositifs sont enlevés. Lorsque les dispositifs microfluidiques sont détachés lentement du plat ( Figure 2c Et 2d ) resteront dans la position à motifs ( Figure 3 et Figure 5a ).
Deux types de dispositifs microfluidiques sont utilisés: Neuro Device et Co-Culture Device. Le premier permet une identification facile des axones, des dendrites et des corps cellulaires. Le soma reste dans la chambre supérieure du soma tandis que les axones et les dendrites poussent le long des canaux microfluidiques ( Figure 5a ) vers la chambre axonale.
Il est recommandé que les puces PDL soient ajoutées aux cellules à raison de 10: 1 et que la plupart des perles qui ontNous n'avons pas adhéré à la culture pour être éliminé en lavant les cellules une fois avec NBM suite à l'incubation de 1 h ( Figure 3 ). Après l'adhésion du talon PDL aux neurites, le complexe PDL-perle-neurite est tiré et peut être étendu sur de grandes distances. Le neurite nouvellement formé peut être connecté précisément aux neurites ou soma millimètres ( Figure 5b -5e ). Le taux de réussite pour tirer un nouveau neurite pour les premiers 3 μm à des vitesses inférieures à 1 μm / min est> 95% (n = 206). Le taux de réussite pour connecter le nouveau neurite à une autre cellule est de 70% (n = 30). La connexion est très fragile dans les 18 premières heures, principalement parce que le nouveau neurite est un filament de moins de 1 μm de diamètre ancré par un 10-PDL-perle. Si le plat est rapidement déplacé pendant les premières minutes de contact, la turbulence résultante du milieu peut provoquer le roulement du cordon et par conséquent l'adhérence à perdre. Cependant, si l'échantillon n'est pas shaKen, en 30 minutes, le cordon s'attache aux neurites sur le plat et la nouvelle connexion reste pendant au moins 48 h. Voir la figure 4 pour un schéma de la configuration.
La position PDL-bead sur la culture peut également être utilisée pour identifier facilement l'emplacement du neurite connecté ( figures 6d-6e ). Après l'initiation, l'extension et la connexion d'un nouveau neurite, un second cliché PDL non adhérent, ramassé via le micromanipulateur, est utilisé pour créer un deuxième site d'adhérence entre le neurite initié et la deuxième population neuronale. Le second PDL-bead est placé au-dessus du nouveau neurite, en le compriant de telle sorte que le nouveau neurite entre en contact avec la deuxième population neuronale 11 . Cela favorisera l'adhésion à la deuxième population neuronale ( figure 5f ).
Le dispositif de population multiple enabLa croissance de 4 populations neuronales isolées sur le même plat. Chaque population neuronale est confinée à un rectangle de 4 x 7 mm séparé des autres populations neuronales par des trous de 100 ou 200 μm ( figure 6a ). Les neurones sains peuvent se développer à l'intérieur des appareils pendant plusieurs semaines. Habituellement, les populations neuronales restent isolées jusqu'à 48 h après le retrait de l'appareil. Après cette période de 48 h, les neurones ont tendance à se développer vers des populations neuronales voisines et forment des liens naturels. Avant de relier deux populations isolées, il faut vérifier que les populations sont effectivement vraiment isolées en examinant l'espace entier au microscope pour établir qu'il n'y a pas de lien entre les deux populations neuronales ( figure 6b ).
Après la connexion, les échantillons ont été incubés pendant 24 h et des enregistrements électriques de puces couplées ont été effectués pour déterminer si les nouveauxLa neurite formée utilisée pour connecter deux populations neuronales isolées était fonctionnelle et capable de transmettre des signaux électriques. Un neurone de la population un, situé à moins de 100 μm du rayon du site où le neurite induit a été initié, a été choisi pour enregistrer les potentiels d'action présynaptiques (PAP). Ce neurone était considéré comme la cellule présynaptique. L'activité excitatrice ou inhibitrice postsynaptique a été enregistrée à partir d'un neurone dans la population deux, de l'autre côté de l'espace, situé dans un rayon inférieur à 100 μm de la connexion micromanipulée ( Figure 7a- 7c ). Les enregistrements dérivés des connexions induites mécaniquement ont été analysés et comparés à ceux des populations neuronales naturellement connectées et des populations non connectées ( figure 7 ). Les réponses électriques après PAP enregistrées à partir de neurones connectés naturellement et par micromanipulation sont significativement plus élevés et temporellement en corrélation avec la présynaptiqueActivité ( Figure 7 ).
Figure 1: Normalisation des cultures neuronales à l'aide de dispositifs microfluidiques 7 . (A) Assemblage du dispositif: lorsque les dispositifs microfluidiques sont correctement assemblés sur une surface sèche, toutes les chambres sont visibles. ( B ) Plaquage cellulaire: plaquer les cellules en haut à droite et les cellules doivent se déplacer vers le puits de gauche. ( C ) Densité cellulaire: juste après le placage, vérifier le microscope si la concentration des cellules est adéquate. ( D ) Après 1 d en culture, les neurones de l'hippocampe sont bien adhérés à proximité des microcanaux et commencent à former des neurites. Cliquez ici pour voir un grand Er version de ce chiffre.
Figure 2 : Entretien de cultures neuronales saines pendant plusieurs semaines 7 . (A) Ajouter un milieu tous les 2-3 jours et garder un ménisque positif dans les puits supérieurs des chambres microfluidiques afin que les cellules contiennent un apport constant de nutriments. ( B ) Garder les cellules dans une plaque plus grande avec un plat contenant de l'eau pour réduire l'évaporation moyenne. ( C ) Utiliser une pointe stérile et des pinces pour ( d ) retirer facilement les microdispositifs. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : Emplacement de la pipette déposant des perles dans des cultures. Une fois que le dispositif microfluidique a été retiré, les neurones sont visibles sur la lamelle. Lors du dépôt de perles, placez la pointe de la pipette de sorte qu'elle soit au centre des cellules. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: schéma d'un montage typique de névrite. L'échantillon repose sur un étage (piézo-actionné) et peut être consulté par le haut par 2 micropipettes maintenues dans des micromanipulateurs et reliées à des seringues de 1 mL par des tubes en plastique. L'échantillon est accessible optiquement par le bas par un objectif connecté à une caméra CCD qui envoieS à une CPU. Un tube d'entrée alimente une solution saline physiologique oxygénée à l'échantillon, qui repose au-dessous de celui-ci, et un tube de sortie relié à une seringue permet le retrait de la solution en cas de débordement. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : adhérence à la plaque PDL aux neurones et à la micromanipulation par pipettes 7 . (A) Les neurones restent organisés en motifs après élimination des chambres microfluidiques permettant une identification facile des soma et des neurites. ( B ) La micromanipulation des billes PDL adhérant aux neurites permet l'initiation des neurites, l'extension ( c ) et la connexion ( d ),Suivi de la libération du PDL-bead à partir de la pipette ( e ). ( F ) Après avoir contacté deux populations neuronales isolées (flèche du bas), un deuxième micromanipulateur de puces PDL et de pipettes (flèche supérieure) sert à établir un deuxième point d'adhérence, à quelques centaines de microns d'intervalle, le premier point de contact et à garantir une fonction les liaisons. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 . Initiation, allongement et connexion de nouvelles neurones pour relier deux populations isolées à l'aide d'un dispositif de population multiple et d'une micromanipulation 7 . (A) Le dispositif isole 4 populations neuronalesEntre 3 intervalles de 100 ou 200 μm chacun. ( B ) Après avoir retiré l'appareil, sélectionnez un écart et certifiez qu'aucun neurite ne relie les 2 populations individuelles. ( C ) Le schéma de la configuration expérimentale comme visible dans le microscope optique, indique la position de deux micropipettes et la présence de billes revêtues de PDL. ( D ) En appliquant une pression négative sur une pipette, un cordon PDL collé à une population neuronale est tiré avec la pointe de la pipette, ce qui déclenche une nouvelle neurite. En maintenant la pression négative dans la pipette, le complexe PDL-bead-neurite (vert) peut être tiré, allongant la neurite. ( E ) Les guides de micromanipulation de pipette prolongent le nouveau neurite sur l'espace et la formation d'une connexion avec une nouvelle population neuronale. Pour assurer l'adhérence du nouveau neurite à la deuxième population, un PDL-perle (rouge) est positionné avec une deuxième pipette à la fois sur le neurite étendu et le neurPopulation nationale. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Le Neurite nouvellement induit, allongé et connecté peut transférer l'information entre deux populations isolées de neurones 7 . Les populations neuronales isolées ont été cultivées séparées par un écart de 100 μm dans les micro-dispositifs PDMS. Des enregistrements de pince à patchs jumelés ont été effectués dans la configuration de cellules entières à partir d'un neurone dans la population un et un neurone dans la population deux (de l'autre côté de l'écart) lorsque les deux populations ont été reliées par une manipulation mécanique ( a ), autorisées à s'interconnecter naturellement à travers la Gap ( b ) ou restent non connectés par maintL'écart ( c ). Des traces représentatives d'enregistrements appariés sont indiquées pour chaque condition ( df ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
En utilisant une micromanipulation standard et des dispositifs microfluidiques innovants, une nouvelle technique a été développée pour initier, allonger et connecter de manière précise de nouveaux circuits neuronaux fonctionnels sur de grandes distances. La micromanipulation par pipette est un outil commun dans la plupart des laboratoires de neurosciences 4 , 13 . Le véritable défi pour obtenir des résultats reproductibles et fiables était la normalisation de cultures neuronales saines et positionnées précisément pour la durée de l'expérience (qui peut être sur l'ordre des semaines) grâce au développement de dispositifs microfluidiques pour organiser des cultures cellulaires avec une précision micrométrique. Les cultures cellulaires de haute qualité sont la pierre angulaire de la validation des données. Cela contribue à une imagerie microscopique plus facile et plus rapide et à la normalisation des cultures et des résultats. Les dispositifs microfluidiques ont été conçus pour cultiver des cellules in vitro avec une organisation similaire à celle in vivo . Le dispositif de population unique permetLa croissance des neurites longs et l'identification facile des axones, des neurites et du soma. Le nombre de cellules plaquées dans les chambres microfluidiques détermine la densité neuronale. Par conséquent, en plaçant moins de cellules par périphérique, il est facile d'identifier des neurones individuels proches des canaux. L'axone et les dendrites multiples d'un seul neurone se développent dans un canal. Les dendrites poussent au moins 5 fois plus lentement que les axones 6 , 17 et, après 2 ou 3 semaines , leur croissance dans les canaux est habituellement limitée à 200 μm alors que les axones à croissance rapide peuvent atteindre au-delà de 2 mm 17 . Par conséquent, après avoir ajouté des puces PDL aux échantillons, il est relativement facile d'estimer si les perles adhèrent principalement aux axones ou aux axones et aux dendrites ( Figure 5b - 5f ). Il existe des chances plus élevées de tirer de nouveaux axones et de dendrites en tirant les billes PDL attachées aux neurites de moins de 200 μm, whIl y a plus de chances de ne tirer que de nouveaux axones lorsque vous tirez des puces PDL attachées à des neurites de plus de 500 μm. Le dispositif de population multiple est utile pour la croissance reproductible de populations séculées et saines pendant plusieurs semaines. Ce système de canaux est utile pour étudier jusqu'à 4 types de cellules différentes ou comparer les mêmes cellules avec différents traitements.
En outre, un environnement de culture cellulaire contrôlé et reproductible fournit un cadre idéal pour l'analyse et la manipulation des cellules. Le positionnement précis des cellules sur un plat facilite l'identification des régions d'intérêt ainsi que l'orientation et la navigation à travers ces zones d'intérêt, permettant finalement un contrôle sans précédent sur le site d'initiation des neurites. Une distribution cellulaire contrôlée permet de visualiser plus facilement la connexion nouvellement formée et plus rapidement pour trouver la nouvelle connexion au microscope dans les jours qui suivent l'incubation. En outre, des configurations reproductibles de cellulesPermettent un positionnement facile et précis des indices chimiques, tels que les perles recouvertes de PDL, sur le soma, les dendrites ou les axones 8 . Ensemble, l'imagerie et l'analyse des cellules développées dans des dispositifs microfluidiques sont plus rapides grâce à l'organisation cellulaire standard reproduite dans tous les plats. En outre, les dispositifs sont fabriqués en matériaux biocompatibles, transparents et amovibles, permettant l'imagerie à toutes les longueurs d'ondes visibles et la survie cellulaire à l'intérieur des appareils pendant plusieurs semaines. La miniaturisation des tests cellulaires aide également à recueillir plus de données avec moins de cellules. La consommation à faible volume des dispositifs microfluidiques réduit le nombre de cellules nécessaires par expérience et augmente l'efficacité expérimentale. Par exemple, au lieu de passer plusieurs heures à chercher au microscope pour peut-être 1 ou 2 axones isolés dans un plat, l'appareil de population unique peut être utilisé pour accéder immédiatement à plus de 100 axones isolés par échantillon de cellule. Les dispositifs microfluidiques offrent un système miniaturisé fiable et contrôlé.Environnement de culture cellulaire favorisant l'analyse d'échantillons rares avec le temps d'effectuer des tests multiples.
Les variations potentielles de la technique impliquent la fixation directe du cordon à la micropipe. Dans le protocole actuel, un procédé est décrit pour attacher le cordon à la pointe par aspiration, mais le cordon peut également être collé à la pointe. La colle est la meilleure option si une connexion très stable entre la pointe et le cordon est souhaitable, par exemple si les mesures de force sont réalisées à l'aide de la pipette en tant que capteur ou si l'étude de l'adhérence entre la PDL et le neurite est l'objectif expérimental principal. Dans une autre veine, l'aspiration est avantageuse car elle permet la libération du cordon après le placement sans séparer le complexe de perle de neurite, ce qui permet de faire en parallèle plusieurs connexions. L'aspiration fournit des moyens pour des expériences de ré-câblage à haut débit, une amélioration par rapport à d'autres techniques de manipulation telles que la microscopie à force atomique (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Les deux modifications de cette méthode permettent de sélectionner le site d'initiation des neurites en maintenant simplement un cordon en contact avec une dendrite afin de former des synapses. Cependant, la stratégie d'incubation de plusieurs perles comme décrit à l'étape 7 économise du temps au stade de la manipulation et est recommandée si un contrôle précis sur le site d'initiation n'est pas nécessaire dans l'expérience.
Les recherches futures pourraient viser à résoudre diverses limitations instrumentales, à savoir le contrôle de la température et l'accessibilité des échantillons. Les propriétés mécaniques de la membrane cellulaire peuvent considérablement varier à différentes températures 27 . Idéalement, toutes les expériences devraient être effectuées à 37 ° C dans un milieu neuronal et des conditions adéquates (contrôles corrects de la pression et de l'humidité du CO 2 ). Cependant, il n'était pas possible d'utiliser un incubateur à cellules fermées, car l'accès aux échantillons du haut est nécessaire pour les micromanipulateurs, à partir duBas pour le microscope et du côté pour bouger la scène. Par conséquent, la perfusion à température ambiante a été utilisée. Dans le même ordre d'idées, étant donné que la mise en place n'a que suffisamment d'espace pour accueillir 2 micromanipulateurs, il faut près de 1 h pour établir une connexion unique, il y a une limite au nombre d'expériences que l'on peut effectuer. Ce problème pourrait être abordé avec un manipulateur qui tire plus d'un cordon à la fois. Une autre amélioration potentielle de ce protocole est la capacité d'enregistrer la hauteur du complexe de perles-pipettes à partir de la surface de l'échantillon. L'incapacité de le faire peut conduire à des imprécisions lors de l'abaissement du deuxième cordon et le placer sur le neurite induit pour le réparer. La perle est abaissée au-dessus de la nouvelle neurite dans une région riche en neurites jusqu'à ce que le nouveau neurite et ceux du plat soient dans le même plan focal. Le nouveau neurite n'est jamais entre le perle et le plat, mais toujours entre un coussin de matière cellulaire et le cordon, donc la compression est réduite. En outre,Le nouveau neurite est observé pendant 10 min au microscope pour évaluer si les gonflements focaux des neurites sont formés près du cordon. Comme décrit dans la référence 16 , la présence de gonflements indique une dégénérescence des neurites. Néanmoins, étant donné que l'application de diverses quantités de pression aux axones peut conduire à des changements physiologiques 16 , les recherches futures pourraient se concentrer sur l'adaptation des pipettes-sondes en leur fixant des réflecteurs et en surveillant le déplacement perpendiculaire à la surface de l'échantillon avec des méthodes AFM. Enfin, peut-être le plus grand défi pour ce protocole est de tester la fonctionnalité de la connexion manipulée. La technique la plus directe, la plus fiable et la plus bien établie sont les enregistrements de pinces à patchs à cellules entières appariés. Cependant, le taux de réussite de l'enregistrement régulier de la pince de patch couplé est très faible (<25%) 18 . La pince à patchs à cellules entières présente plusieurs inconvénients, y compris un long temps de configuration, un nombre limité d'expériences / jour, un temps d'enregistrement limité (~ 30Min.), Faible rendement expérimental pour les enregistrements appariés et la mort cellulaire après les mesures. En raison de ces défis techniques, le rendement expérimental des enregistrements couplés à la pince de patch à cellules entières après la micromanipulation est très faible. De meilleures plates-formes et techniques sont nécessaires pour stimuler, enregistrer et comparer plus précisément l'activité neuronale dans les connexions naturelles et micromanipulées.
L'importance de la tension dans la croissance axonale est connue depuis les premiers jours de la neuroanatomie - se référant à elle comme un étirement passif 20 . Au début du développement embryonnaire, les neurites migrent à travers de petites distances pour atteindre leurs cibles. Comme la plupart des cellules se divisent et se dupliquent, les axones sont soumis à des forces continues pour allonger et ajuster leur longueur à la croissance embryonnaire 20 , 21 . Plusieurs groupes ont essayé de tester les limites de la croissance des neurites en appliquant des indices chimiques et / ou une tension mécanique au neuRons (pour examen, voir la référence 22 ). Dans ces rapports 23 , 24 , 25 , 26 ainsi que pendant la croissance physiologique, les neurites sont tirés lorsqu'ils sont attachés à un substrat. La principale différence dans notre configuration est que dans la technique actuelle, les nouveaux neurites n'ont que deux contacts d'adhérence; À la base, le neurite est attaché au neurone et à la pointe, le neurite est attaché à la perle. Au cours de l'allongement, les composants de la nouvelle neurite ont la liberté de se disperser de la manière la plus efficace pour supporter les forces de traction. Plus important encore, ce protocole décrit comment reproduire ces expériences sans provoquer de rupture de neurites ni de dégénérescence, en fonction d'études antérieures sur la formation de contacts synaptiques 8 et sur la résistance des axones à la pression 16 montrant comment utiliser les micro et nanotools àTire continuellement les neurites avec la force appropriée. Les taux d'extension des neurites décrits ici (1,2 mm / h) sont 30 à 60 fois plus rapides que les taux in vivo des axones à plus forte croissance du système nerveux périphérique (0,02 à 0,04 mm / h) 28 . Par rapport au même type neuronal in vitro , les taux d'extension axonale décrits ici sont 7,5 fois plus rapides que les taux de croissance décrits par d'autres auteurs à un stade de développement antérieur (0,1 mm / h) 4 . Différents types de neurones ont été trouvés pour étendre les axones à différents taux intrinsèques qui varient selon plusieurs plis 29 . En outre, les axones du système nerveux central perdent habituellement le taux élevé de croissance axonale après l'inervation cible in vivo 29 et 3 d de culture in vitro 6 . Par conséquent, la technique d'extension axonale actuelle devrait être testée avec différents types de neurones pour mieux comprendreE limites de l'extension des neurites.
La micromanipulation par pipette et les dispositifs microfluidiques sont des techniques démontrées pour créer de nouveaux neurites fonctionnels et pour positionner de manière contrôlable ou (re) câbler des réseaux neuronaux. Cette plate-forme est idéale pour des mesures systématiques et standardisées. Il introduit la reproductibilité et le contrôle in vivo dans des expériences sur des réseaux complexes de neurones. Les taux d'extension atteints sont supérieurs à 20 μm / min par rapport aux distances à l'échelle millimétrique et les connexions fonctionnelles sont établies. Ces résultats montrent, de façon inattendue, que la capacité intrinsèque des axones pour l'allongement, y compris celle de leurs composants cytosquelettiques, est beaucoup plus rapide qu'on ne le pensait auparavant 10 , 11 , 12 . Cette approche mécanique proposée contourne les stratégies chimiques lentes et représente donc un changement de paradigme pour les développements thérapeutiques pour restaurer la connectivité neuronale après une blessureEt pour la micro-neuro-ingénierie des réseaux de neurones artificiels pour leur étude contrôlée in vitro . Ces résultats ont également un impact majeur sur la médecine régénératrice et les approches de neuro-ingénierie avec implication directe pour les thérapies qui visent à reconnecter les circuits neuronaux après un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives. Cette plate-forme ouvre la porte à l'obtention de données sur la communication des neurones, la modulation du signal ainsi que la croissance et la régénération. C'est une nouvelle façon de régénérer mécaniquement le SNC et des techniques similaires peuvent permettre la restauration de la fonction après une blessure. En outre, cette technique peut être utilisée pour créer des réseaux neuronaux conçus de manière systématique comme nouvelles plateformes de bioessai pour la découverte de médicaments et la validation de cibles. C'est un précurseur du câblage direct des interfaces robustes cerveau-machine.
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Disclosures
L'auteur Margaret H Magdesian est le PDG d'Ananda Devices qui produit des instruments utilisés dans cet article.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Yoichi Miyahara pour de nombreuses discussions et idées utiles. MA et PG reconnaissent le financement du CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
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