Summary
A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.
Abstract
A proteína Cpf1 associada ao CRISPR cliva o DNA de cadeia dupla sob a orientação do ARN CRISPR (crRNA), gerando extremidades pegajosas. Por causa desta característica, o Cpf1 tem sido usado para o estabelecimento de um padrão de montagem de DNA chamado C-Brick, que tem a vantagem de longos sites de reconhecimento e cicatrizes curtas. Em um vetor C-Brick padrão, existem quatro sites de reconhecimento Cpf1 - o prefixo (sites T1 e T2) e o sufixo (sites T3 e T4) - partes biológicas de DNA flanqueando. A clivagem dos locais T2 e T3 produz extremidades adesivas complementares, que permitem a montagem de partes de DNA com sites T2 e T3. Enquanto isso, uma pequena cicatriz "GGATCC" é gerada entre partes após a montagem. À medida que o plasmídeo recém-formado contém novamente os quatro locais de clivagem Cpf1, o método permite a montagem iterativa de partes de DNA, que é semelhante à dos padrões BioBrick e BglBrick. Um procedimento descrevendo o uso do padrão C-Brick para montar peças de DNAÉ descrito aqui. O padrão C-Brick pode ser amplamente utilizado por cientistas, estudantes de graduação e graduação e até amadores.
Introduction
A padronização de partes biológicas do DNA é importante para o desenvolvimento da biologia sintética 1 . O desenvolvimento de um procedimento de montagem de DNA pode substituir projetos experimentais ad hoc e remover muitos dos resultados inesperados que ocorrem durante a montagem de componentes genéticos em sistemas maiores. O padrão BioBrick (BBF RFC 10) foi um dos primeiros padrões de montagem de DNA propostos. Ele usa a seqüência de prefixo (contendo sites de corte EcoRI e XbaI) e a seqüência de sufixos (contendo sites de corte SpeI e PstI) 2 , 3 . Como XbaI e SpeI têm extremidades coesivas complementares, as partes de DNA BioBrick que são cortadas com XbaI e SpeI podem ser unidas, gerando um novo BioBrick para uma montagem iterativa adicional.
Alguns defeitos foram identificados com o uso do padrão BioBrick 4 . Por exemplo, produz uma cicatriz de 8 pbEntre as partes de DNA, o que não permite a construção de proteínas in-fusion. Além disso, os quatro tipos acima mencionados de sites de restrição de 6 pb devem ser removidos das partes de DNA, o que é muito inconveniente. O padrão BglBrick foi estabelecido para resolver o primeiro problema 5 . Ele cria uma cicatriz "GGATCT" de 6 pb, produzindo Gly-Ser e permitindo a fusão de múltiplas proteínas ou domínios protéicos. IBrick foi desenvolvido para lidar com o segundo problema 6 . Ele usa endonucleases homing (HEs) que reconhecem longas seqüências de DNA. Como os sites de reconhecimento HE raramente existem em seqüências de DNA naturais, o padrão iBrick pode ser usado para a construção direta de peças iBrick sem modificar suas seqüências de DNA. No entanto, o padrão iBrick deixa uma cicatriz de 21 pb entre as partes do DNA, o que pode ser o motivo da sua impopularidade.
Nos últimos anos, as repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) foi desenvolvido rapidamente 7 , 8 . Entre as proteínas associadas a CRISPR (Cas), a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada. Ele apresenta principalmente interrupções de DNA de cadeia dupla (DSBs) com extremidades sem corte 9 .
Em 2015, Zhang e colaboradores caracterizaram o Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1) pela primeira vez. Ele pertence ao sistema CRISPR-Cas da classe 2 do tipo V e é uma endonuclease 10 CRISRP RNA (crRNA). Ao contrário de Cas9, o Cpf1 apresenta um DSB com uma subida de 5 ou 5 nt 5 '10. Com base nessa característica, Cpf1 foi usado para desenvolver um padrão de montagem de DNA, C-Brick 4 . Em um vetor padrão C-Brick, quatro locais alvo Cpf1 de T1 / T2 prefixados e T3 / T4 sufixos flanqueiam as partes biológicas; Isso é semelhante ao padrão BioBrick. Como a divisão dos sites T2 e T3 pRoduces extremidades adesivas complementares, é possível realizar a montagem iterativa de partes de DNA ao gerar uma cicatriz "GGATCC" entre as partes. Notavelmente, o padrão C-Brick tem duas vantagens principais: reconhecendo longas sequências alvo e deixando cicatrizes curtas. A cicatriz de 6 pb "GGATCC" gerada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite a construção de proteínas de fusão. Além disso, o padrão C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick.
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Protocol
1. Preparação de crRNA
- Preparação de modelos CRRNA
- Re-suspenda os oligonucleótidos individuais ( Tabela 1 ) em água sem RNase até uma concentração de 10 uM.
- Adicionar 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia superior (T7-F na Tabela 1 ), 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia inferior ( Tabela 1 ) e 5 μL de tampão de recozimento 10x a um tubo de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
NOTA: Seis diferentes oligonucleótidos de cadeia inferior são mostrados na Tabela 1 , cada um dos quais deve ser emparelhado individualmente com a T7-F de topo. As letras minúsculas na Tabela 1 representam a sequência a transcrever para a sequência guia de crRNA. 10x Taq PCR buffer pode ser usado em vez do 10x annealing buffer. - Coloque o tubo de PCR em um termociclador.
- Execute o programa de recozimento: desnaturação inicial a 95 ° C para5 min e depois um tempo de enchimento de 95-20 ° C, com uma diminuição de 1 ° C por minuto no termociclador.
NOTA: Imediatamente use as amostras para o passo 1.2.1.
- Transcrição e purificação de crRNA
- Adicionar 38 μL de água sem RNase, 8 μL do molde do passo 1.1.4, 20 μL de tampão de transcrição 5x T7, 20 μL de mistura de NTP (10 μM), 4 μL de inibidor de RNase recombinante (RRI) e 10 ΜL de polimerase de ARN T7 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 100 μL.
- Coloque o tubo de microcentrífuga em banho-maria a 37 ° C durante a noite (por cerca de 16 h).
- Use um kit de limpeza e concentração de ARN para purificar o ARN transcrito; Siga o protocolo do fabricante.
- Quantificar os RNAs com espectrofotômetros UV-Vis e diluir o RNA para uma concentração de 10 μM. Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -80 ° C.
NOTA: A sequência crRNAS estão listados na Tabela 2 .
2. Construção de peças de C-Brick ( ou seja, a inserção de peças biológicas em um vetor padrão de C-Brick)
NOTA: Esta etapa tem três sub-etapas. Para partes biológicas curtas ( por exemplo, promotores e terminadores), é melhor usar o método de PCR direta para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick 4 . Toda a sequência do vetor é mostrada nos dados suplementares, e a seqüência de prefixo e sufixo é mostrada na Figura 1 (etapa 2.1, abaixo). Para as partes biológicas que podem ser facilmente obtidas através da PCR ( por exemplo, com modelos de DNA genômico, plasmídeos ou sequências de DNA sintetizadas de novo ), é melhor usar o método de montagem sem costura para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick (Passo 2.2, abaixo). Para as peças obtidas dos padrões BioBrick e BglBrick, a restriçãoA digestão mediada por enzima e a ligação mediada por ligadura de ADN de T4 podem ser utilizadas para inserir as partes biológicas num vector padrão C-Brick (passo 2.3, abaixo).
- Construção via amplificação direta de PCR
- Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
NOTA: O extremo 5 'do oligonucleótido contém a sequência da parte do DNA e a extremidade 3' do oligonucleótido contém a sequência do vetor ( isto é, "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" na extremidade 3 'da cadeia dianteira e "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Na cadeia inversa). Ou nenhum saliência ou uma saliência de ~ 20 pb podem ser concebidos no extremo 5 'do oligonucleótido. Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . - Re-suspenda os oligonucleótidos individuais em água ultra pura até uma concentração de 10 μM.
- Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de 2x PCR buffer, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL de cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM) do passo 2.1.2, 0,5 μL de vetor padrão C-Brick (50 ng) como modelo e 0,5 μL De polimerase de DNA de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
- Coloque o tubo diretamente em um termociclador e comece o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Programa Thermocycler: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; Trinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C.
- Adicione 9 μL da mistura do passo 2.1.4 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 1 μL de DpnI e incube durante 1 h num banho de água a 37 ° C.
NOTA: Se os primers não tiverem seqüências sobrepostas, adicione 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) e 0,5 μL de T4 DNA ligase e incubar emUm banho de água a 22 ° C durante 1 h. Caso contrário, se os iniciadores contiverem uma seqüência de sobreposição de ~ 20 nt, transformar diretamente os produtos tratados com DpnI em células compatíveis com E. coli (DH10B) (etapa 2.4). O produto de PCR linearizado será circularizado pelo sistema de recombinação no hospedeiro. - Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -20 ° C.
- Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
- Construção através de montagem sem costura
- Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
NOTA: A extremidade 3 'do oligonucleótido contém a sequência terminal da parte de DNA e a extremidade 5' do oligonucleótido contém o terminal da sequência de vetor padrão linear C-Brick ( ou seja, "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" para o 5 ' -end da cadeia direta e "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" para o extremo 5 'da cadeia reversa). Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . - Re-suspenda os indivíduosOligonucleótidos ual em água ultra pura para uma concentração de 10 μM.
- Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de tampão de PCR 2x, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM ) A partir do passo 2.2.2, 0,5 μL de molde (20-500 ng) e 0,5 μL de DNA-polimerase de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
- Coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
NOTA: Configure o programa do termociclador para: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos por 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (de acordo com a temperatura de recozimento do primário) e 1 min (de acordo com o comprimento das partes biológicas) a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C. - Purificar o produto de PCR usando um sistema de limpeza por PCRKit tem; Siga o protocolo do fabricante.
- Digerir o vetor padrão C-Brick com BamHI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x e 1 μL de BamHI ao tubo de microcentrífuga. Incubar até 2 h a 37 ° C num banho de água.
- Purifique o produto acima usando um kit de sistema de limpeza de gel; Siga o protocolo do fabricante.
- Adicione 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.2.7, 5 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.2.4, 2 μL de tampão de montagem sem costura de 5x e 1 μL de enzima de montagem sem costura a partir de um kit de montagem sem costura Para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 10 μL.
- Coloque isso em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
- Construção por meio de digestão com restrição de medição enzimática e ligadura mediada por DNA ligase de T4.
NOTA: Para as peças obtidas dos padrões BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), a digestão mediada por enzimas de restrição e a ligadura mediada por DNA ligase T4 pode ser usada para inserir a Partes biológicas em um vetor padrão C-Brick.- Digerir as partes padrão BglBrick com BamHI e BglII: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de 10x tampão 3, 0,5 μL de BamHI e 0,5 μL de BglII ao tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
- Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel.
- Ligar o fragmento e o vetor padrão C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.1.12 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10 x T4 DNA ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou livreE armazená-los a -20 ° C.
- Digite as peças padrão BioBrick com XbaI e SpeI: adicione 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
- Digerir o vetor padrão C-Brick com XbaI e SpeI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
- Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento do passo 2.3.4 e o vetor linearizado a partir do passo 2.3.5 com um kit de sistema de limpeza de gel; Seguindo o protocolo do fabricante.
- Ligar o fragmento e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.3.5 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.4 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. de AnúnciosD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Adicione 10 μL dos produtos do passo 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 para a transformação química nas células competentes de E. coli (DH10B).
- Levar vários clones para um tubo Luria-Bertani (LB) líquido de 5 mL e incubar a 37 ° C num agitador (220 rpm) durante a noite.
- Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante.
- Identifique os clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 .
3. Conjunto C-Brick ( Figura 2 )
- Digestão do vetor C-Brick com Cpf1
- Adicionar 22,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL do plasmídeo do passo 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI e 1 &# 181; L de Cpf1 (5 μM) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
NOTA: Cpf1 pode ser comprado comercialmente ou purificado após o protocolo em um estudo anterior 4 . - Para inserir um fragmento de ADN estranho nos locais T1 e T2, adicionar 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Um dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) por mais 30 min.
NOTA: Alternativamente, para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T3 e T4, adicionar 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) por mais 30 min. - Adicione 1 μL de fosfatase alcalina termossensível e incuba o tubo em um banho de água a 37 ° C durante mais 1 h.
- Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o vetor usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Adicionar 21,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL de plasmídeo a partir do passo 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI e 2 μL de Cpf1 (5 μM) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T1 e T2, adicione 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h.
NOTA: Alternativamente, adicione 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h. - Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Adicionar 22,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL do plasmídeo do passo 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI e 1 &# 181; L de Cpf1 (5 μM) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Assembléia de C-Brick e verificação adicional
- Ligar o fragmento de ADN estranho e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL do vetor linearizado (50 ng) do passo 3.1.4 e 6 μL do fragmento de ADN (200 ng) do passo 3.2.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
- Adicionar 10 μL dos produtos de ligação (passo 3.3.1) para a transformação química em células compatíveis com E. coli (DH10B).
- Adicione vários clones a um tubo LB líquido de 5 mL e incube durante a noite em um agitador a 220 rpm e 37 ° C.
- Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante.
- Identificar clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 .
- Execute uma nova rodada de montagem C-Brick. Os clones corretos do passo 3.3.4 podem ser usados como um novo vetor C-Brick ou parte de DNA para uma montagem iterativa adicional de C-Brick, seguindo o mesmo protocolo das etapas 3.1-3.3.
NOTA: T2 'e T3' sSão projetados como o backup de sites T2 e T3 ( Figura 1a ). Para os plasmídeos obtidos a partir do passo 2.3.7, apenas T2 e T3 podem ser utilizados para a montagem padrão do C-Brick.
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Representative Results
Este protocolo demonstrou a montagem de três cassetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). Primeiro, as sequências de codificação dos três genes e terminadores acima mencionados foram clonados individualmente em um vetor padrão C-Brick. Pequenas partes de DNA, promotor e terminador, foram introduzidas no vetor C-Brick através de amplificação por PCR usando primers contendo as partes de DNA curtas no terminal 5 '. Seguiu-se o método de auto-ligadura. Três seqüências codificadoras de cromoproteínas foram primeiro de novo sintetizadas e depois clonadas no vetor padrão C-Brick através de montagem contínua. Os iniciadores foram descritos em um estudo anterior 4 .
Depois disso, as sequências cjBlue, eforRed e amilGFP foram ligadas com sequências de terminadores e promotores no mesmo procedimento mostrado em"Xfig"> Figura 2. As construções corretas foram transformadas em E. coli , demonstrando belas cores ( Figura 3a ). Posteriormente, duas cassetes de expressão de cores foram montadas com o padrão C-Brick para criar mais cores ( ou seja, a cor vermelha do amilGFP plus eforRed, a cor verde do amilGFP plus cjBlue e a cor violeta-clara de eforRed plus cjBlue; Figura 3b ).
Figura 1: Seqüência de DNA da interface padrão do C-Brick e vetor padrão do C-Brick. (A) A seqüência da interface padrão T-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3' de C-brick pode ser reconhecida pelo seu crRNA correspondente e depois introduzida em uma saliência 5 'usando Cpf1. A divisão de T2 e T3 (ou T2 'e T3') produz complementares sobreTrava. Com os oito sites de restrição projetados, o padrão C-Brick é parcialmente compatível com BioBrick e BglBrick. ( B ) Mapa de plasmídeo para o vetor padrão C-Brick com sites de digestão de restrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O fluxo de trabalho para montagem de DNA no padrão C-Brick. Os sites alvo T2 e T3 digeridos com Cpf1 produzem extremidades coesivas complementares de "GGATC" e "GATCC", respectivamente, que podem ser ligadas para gerar uma cicatriz curta "GGATCC". Os procedimentos detalhados podem ser encontrados no passo 3 no texto ("montagem C-Brick"). Clique aqui para Veja uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Pigmentos Bacterianos Coloridos Produzidos por E. coli Harboring Constructs Assemblado no Padrão C-Brick. (A) Três cromoproteínas foram expressas em E. coli cultivadas em uma placa. As bactérias sem cromoproteínas (controle negativo) são mostradas na 4ª placa. ( B ) Três cromoproteínas e três cromoproteínas duplas montadas foram expressas em E. coli cultivadas em meio LB líquido. De 1 a 6, as construções expressaram eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) e eforRed plus cjBlue (6). As bactérias coloridas em uma única placa ou em um único tubo de microcentrífuga foram cultivadas a partir de um único clone verificado pela sequência. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| nome | seqüência | ||
| T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
| T7-T1-R | GaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2'-R | CtagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2-R | GgatcctttctctctctctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3-R | GgatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3'-R | CtctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T4-R | TtcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
Tabela 1: Oligos para a preparação dos modelos de transcrição do CRRNA usados neste estudo. T7-F era o oligonucleótido de cadeia superior, e os outros eram os oligonucleótidos da cadeia inferior. As bases minúsculas na sequência serão transcritas na sequência guia em crRNA.
| Nomes | Sequências de ARN (5'-3 ') | ||
| CrRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
| CrRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
| CrRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
| CrRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA | ||
| CrRNA-T2 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
| CrRNA-T3 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG | ||
Tabela 2: As seqüências de crRNA usadas neste estudo. Os crRNAs foram produzidos através da transcrição in vitro no passo 1 no texto ("Preparação do crRNA").
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Discussion
Este protocolo descreve um procedimento para o padrão de montagem de DNA C-Brick. O passo mais importante neste protocolo é a linearização do vetor padrão C-Brick; A clivagem incompleta do vetor pode afetar seriamente a taxa de sucesso. Além disso, embora o Cpf1 cliva principalmente as sequências de DNA alvo no padrão de clivagem "18-23", também foi detectada uma clivagem incorreta perto das duas bases 4 , o que pode causar um pequeno número de mutações após a montagem do DNA. Portanto, o seqüenciamento do Sanger é necessário para verificar a construção montada.
A eficiência do conjunto C-Brick é menor do que a enzima de restrição tradicional e os métodos de ligação que foram descritos em um estudo anterior 4 . A principal razão que afeta a eficiência da montagem pode ser as características de clivagem imprecisas do Cpf1. No futuro, as melhorias na precisão da clivagem podem ser extremamente úteis para o padrãoNd estão sendo explorados atualmente.
O C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick. Por exemplo, as peças BglBrick podem ser cortadas com BglII e BamHI e depois inseridas no site BamHI de um vetor padrão C-Brick, gerando uma parte C-Brick. No entanto, a direção de inserção da parte BglBrick deve ser verificada, e haveria uma cicatriz "GGATCT" após a montagem. Quando uma parte de DNA de C-Brick é obtida a partir de uma peça BioBrick ( ou seja, com digestão com XbaI e SpeI), ambos os sites T2 e T3 serão destruídos e duas seqüências-alvo Cpf1 (T2 e T3) podem ser usadas.
Como a clivagem Cpf1 requer sgRNA, que é extremamente sensível à RNase, todos os materiais devem ser livres de RNase. Atualmente, todos os vetores padrão do C-Brick, as nucleases Cpf1 livres de RNase e os crRNAs podem ser solicitados comercialmente 12 . Portanto, os procedimentos para o C-Brick são realmente tão simples quanto os do BioPadrão de tijolos.
Nos últimos anos, vários métodos de montagem de DNA úteis foram desenvolvidos e são amplamente utilizados, incluindo o Conjunto Golden Gate 13 , Gibson Assembly 14 e outros 15 . No entanto, como os padrões de montagem de DNA têm o potencial de fornecer reações de montagem econômicas, confiáveis, de alto rendimento e automáticas 5 , os padrões podem facilitar a construção e teste de genes, circuitos genéticos e caminhos recentemente projetados ou re-desenhados 15 , 16 , 17 , especialmente no campo da biologia sintética. Entre os padrões de montagem de DNA atualmente publicados, o padrão C-Brick possui vantagens óbvias e desvantagens 4 ( ou seja, a eficiência da ligação). Se a eficiência de ligadura for melhorada, o padrão pode ser amplamente adotado no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Shanghai Tolo Biotech por sua assistência técnica durante o desenvolvimento do padrão C-Brick. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (Grant No. XDB19040200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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