Summary
Целевой объект специфического датчики представляют инновационный инструмент для анализа молекулярные механизмы, такие как выражение протеина в различных типах болезни (например, воспаление, инфекция и опухолей). В этом исследовании мы описывают количественную оценку трехмерной томографических кишечных макрофагов инфильтрации в мышиных модель колита с использованием конкретного/80-F4 флуоресценции опосредованной томография.
Abstract
Мышиных моделях заболеваний необходимы для научных исследований. Однако многие средства диагностики эндоскопия или томографических изображений не используются регулярно в животных моделях. Обычные экспериментальной отсчетов часто полагаются на посмертное и ex vivo анализов, которые препятствуют внутри отдельных последующих экзаменов и увеличить количество животных исследования необходимы. Флуоресценции опосредованной томография позволяет неинвазивные, повторяющихся, трехмерные и количественные оценки флуоресцентных зондов. Она очень чувствительна и разрешает использование молекулярных органов, которая позволяет для обнаружения конкретных и характеристик различных молекулярных целей. В частности целевые датчики представляют инновационный инструмент для анализа экспрессии генов активации и белков в воспаление, аутоиммунные заболевания, инфекции, заболевания сосудов, миграции клеток, tumorigenesis, и т.д. В этой статье мы предоставляем пошаговые инструкции на этой сложной визуализации технологии для обнаружения в естественных условиях и характеристика воспаления (т.е., F4/80-позитивных макрофагов инфильтрации) в широко используемых мышиных модели кишечные воспаления. Этот метод может также использоваться в других областях исследований, как иммунные клетки или стволовых клеток отслеживания.
Introduction
Животные модели широко используются в научных исследованиях, и многие неинвазивные процедуры существуют для монитора активности заболевания и жизнеспособность, таких как количественная оценка изменения веса тела или анализ крови, мочи и Кала. Однако это только косвенные замещающих параметров, которые также подлежат межличностная изменчивость. Они часто должны дополняться посмертное анализ образца ткани, которая предотвращает последовательного наблюдения на время повторяющихся точек и прямых наблюдений физиологических и патологических процессов в естественных условиях. Появились сложные методы визуализации малых животных, в том числе кросс-секционные изображений, оптических изображений и эндоскопия, который позволяет прямой визуализации этих процессов, а также позволяет для повторных анализов же животных1 , 2 , 3. Кроме того, возможность многократного контролировать различные состояния болезни в то же самое животное может уменьшить количество животных необходимо, которые могли бы быть желательным с точки зрения животных этики.
Несколько различных оптических изображений методы существуют в vivo флуоресценции изображений. Первоначально конфокальная томография использовалась для изучения поверхностных и подповерхностных флуоресцентные события4,5. Недавно однако, томографические системы, которые позволяют для оценки количественных трехмерные ткани были развитые6. Это было достигнуто путем разработки флуоресцентных зондов, которые излучают свет в ближней ИК-области спектра (NIR), предлагая низкой абсорбцией, чувствительных детекторов и монохроматического света источников7. Хотя традиционные срезов тепловизионные методы такие как компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) или УЗИ (США), полагаться главным образом на физических параметров и визуализации морфологии, оптических изображений могут предоставить дополнительную информацию на базовом молекулярных процессов с использованием эндогенного или экзогенного флуоресцентных зондов8.
Достижения в области молекулярной биологии помогли облегчить поколения интеллектуальных и целенаправленных флуоресцентных зондов молекулярные для все большего числа целей. К примеру рецептор опосредованный поглощения и распределения в области заданного целевого объекта могут быть визуализированы с помощью карбоцианиновыми антител, меченных производная9. Обилие доступных антител, которые могут быть помечены в качестве конкретных индикаторов в недоступные участки тела, обеспечивает беспрецедентные понимание молекулярных и клеточных процессов в моделях tumorigenesis и нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, иммунологические и воспалительных заболеваний7.
В этом исследовании мы описывают использование флюоресценции опосредованной томография в мышиных модель колита. Декстран сульфат натрия (DSS)-индуцированного колит это стандартная модель химически индуцированных мыши кишечного воспаления, что напоминает воспалительное заболевание кишечника болезнь (IBD)10. Это особенно полезно оценить вклад иммунной системы до развития воспаления кишечника11. Поскольку набор, активации и проникновение моноцитов и макрофагов представляют собой важнейшие шаги в патогенезе IBD, Визуализация их найма и кинетика инфильтрации имеют важное значение для мониторинга, например, эффект потенциал лечебных веществ в доклинических параметр12. Мы опишем индукции DSS колит и продемонстрировать томография опосредованной характеристика макрофагов инфильтрации в слизистую оболочку кишки с помощью молекулярных томография флуоресценции для конкретных визуализации моноцитов/макрофагов маркера F4/80 13. Кроме того, мы показываем вспомогательные и дополнительные процедуры, такие как антитела маркировки; экспериментальная установка; и анализа и интерпретации полученных изображений, в корреляции с обычными отсчетов такие индексы активности болезни, поток цитометрии и гистологический анализ и иммуногистохимии. Мы обсуждаем ограничения этой техники и сравнения с другими визуализации формы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были утверждены шведским für натур, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen согласно немецкого закона о защите животных (Tierschutzgesetz).
1. материалы и экспериментальной установки
- Уход за животными.
- Использование пола и возраста соответствием мышей любой DSS-подвержены деформации (например, C57BL/6) на 20-25 г веса.
- План по крайней мере пять или более мышей в экспериментальной группе и Дом мышей согласно рекомендациям местного ухода за животными.
- Предоставить стандартный грызунов Чоу диеты и автоклавного питьевой воды ad libitum.
- Удалите стандартные Чоу и заменить его бесплатно люцерны Чоу по меньшей мере три дня до начала сканирования для уменьшения эндолюминальные auto флуоресценции.
- Индукция острого колита DSS-индуцированной.
- Растворите 2 g DSS (молекулярный вес ~ 40,000 Da) в 100 мл газобетона питьевой воды для получения на 2% (w/v решение).
- Заполнить питьевой мышей исключительно с DSS решения и оценить 5 мл жидкости на мышь в день. Обеспечить же питьевой воды без DSS в мышах управления10.
Примечание: Монитор мышей ежедневно до конца эксперимента. Усыпить мышей, потерять больше, чем 20% от их первоначального веса или умирающий, которые стали (то есть, упорно сгорбившись осанки, снижение движения, трудился дыхание, заметно возводить пальто) согласно местных применимые руководящие принципы на животных благосостояния.
- Подготовка флуоресценции опосредованной томография.
- Ярлык желаемого антител (например, крыса анти мыши F4/80) с флуоресцентной краской (например, Cyanine7, λвозбуждения: 750 нм, λвыбросов: 776 Нм) как описано в протоколе производителя. Dialyze очищенных антител в соответствующей диализа мембраны (размер пор < 50-100 кДа) против 1 Л 0,15 М натрия хлорида для по крайней мере 2 часа или на ночь.
- Передача антитела к 1 Л 0,1 М NaHCO3 и dialyze для минимум 2 ч.
- Растворить необходимое количество Люминесцентную краску в диметилсульфоксида (ДМСО) (10,8 мкл/мг антитела) и добавить его в раствор антител. Используйте Люминесцентную краску кратной Молярная сверх для достижения краситель белка соотношение 1:3.
- Инкубировать в темноте при температуре 4 ° C для 1 h. удалить немеченого антитела диализа против 1 Л 0,15 М натрия или с помощью столбца опреснительной адаптер PD-10 и решимость в фосфат амортизированное saline (PBS) для применения в естественных условиях .
- Определите окончательный антитела концентрации и маркировки соотношение методом спектрофотометрии.
- Измерить концентрацию белка на поглощение 250-330 Нм и рассмотреть дополнительные поглощение красителя. Исправить максимум поглощения в 280 Нм (белка), 11% максимум поглощения в 750 Нм (следующий шаг) для маркировки Cyanine7.
- Измерения разрежения соединение (обычно 1:10) на 250-800 Нм и извлечь концентрацию Cyanine7 на 750 Нм.
- Определить коэффициент краситель белка как: краска/антитела = максимальное поглощение на 750 Нм / 200000 / (максимум поглощения в 280 Нм - 0,11 х Макс поглощения на 750 Нм) / 170 000.
- Держите раствор антител на 4 ° C и защитить его от света во избежание обесцвечивания перед инъекцией.
- Загрузите необходимые антитела объема раствора в стерильный шприц непосредственно перед инъекций и щит от света до тех пор, пока он используется.
- Определите оптимальные сроки введения зонда и сканирования, в зависимости от трассирующими Фармакокинетика.
- Анестезировать мышей, с помощью изофлюрановая 1,5-2,5% вдыхают кислород или надежно разместить их в специальный фиксатор для инъекции Вену хвост помечены антител.
- Для полнометражных антител придать обозначенное антитело по крайней мере 24 ч до начала сканирования, такие как анти мыши F4/80 макрофагов визуализации в мышиных колит. Внутривенно вводить мышей (и.в.) через хвост вен с обозначенное антитело в сумму, соответствующую 2.0 нмоль красителя.
- Использование одинаково помечены неспецифических антител (например, крыса IgG или другой изотипа соответствующее основное антитело наследия) как элемент изотипа в дозах эквивалентные тем конкретным зонда.
Примечание: Результаты в vivo сканирование после инъекции комплекса управления может служить ориентиром для толкования конкретного ПЭП, визуализации данных. - Использование электрической бритвой бриться мех животных в области живота, чтобы свести к минимуму световое отражение и поглощение.
- Ярлык желаемого антител (например, крыса анти мыши F4/80) с флуоресцентной краской (например, Cyanine7, λвозбуждения: 750 нм, λвыбросов: 776 Нм) как описано в протоколе производителя. Dialyze очищенных антител в соответствующей диализа мембраны (размер пор < 50-100 кДа) против 1 Л 0,15 М натрия хлорида для по крайней мере 2 часа или на ночь.
2. техническое оснащение
- Используйте устройство ветеринарных флуоресценции опосредованной томография (ДРМ) для малых животных флуоресцирования ( рис. 4).
- Создайте новое исследование для каждого проекта, нажав кнопку «Новое исследование» кнопку и включить в исследование описание соответствующих индикаторов, включая изображений параметры и доз для будущей справки.
- В рамках этого исследования, создание исследовательских групп согласно дизайн соответствующие исследования (например, для конкретных трассирующими и неспецифическим изотипа контроля), нажав кнопку «Новая исследовательская группа» кнопку. Оснащения каждой исследовательской группы с соответствующим количеством животных.
- Калибровки системы для трассировочного конструкций.
- Выполните калибровку для каждого пакета Трейсеры нормализовать вариации в маркировке и дать количественное измерение данным OI.
- Следуйте рекомендациям производителя прибора для калибровки каждой отдельной системе; При выборе «Добавить новый трассировочный» эта система будет обеспечивать руководство через шаги. Обеспечивают разбавления раствор прикладной антител и рассчитанные абсолютной концентрации трассирующими зонда.
- ДРМ использовать ткани подражая Фантом характеристик определенной толщины и поглощения (напоминающие жизненно важные ткани) и заполнить его с конкретным объемом используется раствор антител. Эта мера на устройстве ДРМ.
Примечание: Система будет использовать ссылку измерение предоставленных зонда, вместе с заданной концентрации, для вычисления абсолютного трассирующими концентрации от будущего в естественных условиях измерения.
- Использовать нагреваемые экспертизы кассету с температурой от 42 ° C.
Примечание: Это предотвращает мышей становится гипотермического во время экзамена.
3. животных анестезии
- Использовать непрерывный поток 1,5-2% vol % изофлюрановая ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) и 1.5 L O2мин., чтобы анестезировать мышей.
4. флуоресценции опосредованной томографическое сканирование
Примечание: Адаптировать следующие детали, которые являются специфическими для ДРМ система, используемая в этом исследования (см. Таблицу материалов) для альтернативных флуоресценции отражения тепловизионных устройств или систем ДРМ, при необходимости.
- Место наркотизированных мышь на его обратно в кассету экзамен.
- Процедура сканирования.
- Вставьте кассету в тепловизионной системы и закройте его немедленно обеспечить непрерывное обезболивание. Выберите соответствующий образец из исследовательской группы, созданные ранее. Выберите управляемые tracer в раскрывающемся меню для обеспечения правильно рассчитанные значения концентрации трассировщик.
- Приобрести флуоресценции отражения изображения в соответствующие волны (720 Нм для Cyanine7) для планирования сканирования и наброски поля сканирования, нажав кнопку «получить изображение со сканера».
- Смотрите, что поля сканирования отображается как наложения на изображение отражения флуоресценции. Настроить его на области интереса (например, двоеточие или живота), избегая воздуха или районах оставшихся меха. В зависимости от изображения установите количество изображений точек данных в пределах области сканирования, выбрав из грубого среднего и мелкого резолюции поля сканирования в меню справа.
Примечание: Имейте в виду, что штраф сканирования поля может предложить лучше пространственным разрешением за счет сканирования значительно больше времени. - Начать приобретение данных/изображения на выбранной длине волны, нажав кнопку «Сканировать».
Примечание: Время сканирования для проверки средне тонкий целом живота будет около 5 мин; в это время каждая точка данных отдельно освещен лазерным возбуждением, и записан результирующий флуоресценции. - Удаление животное из изображений кассету в конце сканирования и позволяют животное, чтобы восстановить полностью перед установкой его обратно в клетке.
- Повторите ДРМ, если сочтет это необходимым в различные моменты времени в ходе эксперимента (например, дни 0, 5 и 9-10 (конец эксперимента)), но рассмотреть накопление антител в организме, поэтому увеличение фонового сигнала флуоресценции.
5. После сканирования
- Поместите указатель мыши в отдельной клетке на бумажное полотенце под лампой потепления красный свет и контролировать мышь для признаков дискомфорта или бедствия до полного восстановления. Поместите курсор мыши обратно в его соответствующей клетке, когда полностью проснуться.
- Усыпить мышей в конце эксперимента по доставке CO2 в изолятор в дозе 100% (v/v), 100 vol % и 3 Л/мин. Не предварительно заполнить камеры с CO2, как внезапное воздействие высоких концентраций CO2 может привести к беде. Проверьте смерти после того, как мышь остановилось дыхание последующих вторичный режим эвтаназии как быстрое шейки матки дислокации.
- Explant толстой кишки по брюшной полости лапаротомия и выполнить проверку ex vivo explanted толстой кишки, как описано в шагах 4.2.1 - 4.2.4. Откройте каждый Колон, продольно с помощью Metzenbaum Ножницы хирургические и тщательно промыть физиологическим раствором перед подготовкой для дальнейшего анализа.
- Используйте скальпель вырезать фрагмент 0,5 см от дистальной части толстой кишки и сразу же поместить его в трубу криогенных 1,5 мл. Замораживания ее в жидком азоте и хранить на-70 ° C до дальнейшего использования (например,миелопероксидаза (МПО) измерения).
- Используйте деревянную палочку и свернуть оставшиеся продольно открыт двоеточие от дистальной к проксимального конца, с слизистой оболочки наружу («рулет техника»), для гистологического анализа. Место подготовки в фиксатор (см. Таблицу материалы) и заморозить-80 ° C14.
6. данные восстановления и интерпретация
- Используйте средство восстановления соответствующих изображений программное обеспечение для создания 3D карты распределения флуоресценции из необработанных изображений данных; сканирование автоматически добавляются к средству восстановления, когда при сканировании, функция «добавить в очередь реконструкции» выбран.
- В противном случае выберите сканирования в раскрывающемся меню под соответствующие исследования и исследовательская группа, щелкните правой кнопкой мыши Проверка и выберите «Добавить к восстановлению».
- Для дальнейшего анализа Загрузите набор данных в программное обеспечение для анализа. В раскрывающемся меню в верхней панели выберите соответствующие исследования, а затем выберите исследовательской группы и отдельных животных из меню справа; будут показаны все проверки, выполняемые для этого животного. Выберите правильный сканирования и нажмите кнопку «Загрузить».
Примечание: 3D-реконструкции трассировщик распределения будет отображаться на левой стороне как наложение изначально приобретенных флуоресценции отражения изображения. Модель можно поворачивать и увеличенное для облегчает анализ. - Выявление очагов накопления (например, печень или мочи мочевого пузыря) неспецифических ярлык на реконструированной 3D картах и дифференцировать от тканях (например, кишки или кишечника).
- Из верхней панели выберите форму ROI, наиболее подходящим для целевого объекта. Ткани-мишени ярлык как регионы интереса (ROI), поместив соответствующие инструменты измерения в программное обеспечение для анализа; программное обеспечение будет предоставлять интенсивности флуоресценции для рентабельности, а также (Пико-) Молярная количество трассировщик, сканирования откалиброван для.
- Выберите общее количество трассировочных в соответствующие ROI, нормированный ROI размера, как наиболее подходящий эквивалент для оценки активности болезни в корреляции с воспалительного инфильтрата (гистология).
Примечание: Другие особенности ROI может быть выбран при необходимости как представителя определенной модели.
7.Ex Vivo Анализы
- Гематоксилином и эозином и пятнать иммунофлюоресценции.
- Deparaffinize разделы, помещая их в 70% этанола (EtOH) 2 мин; Потом смойте дистиллированной воды. Пятно с гематоксилином решение для 5 мин и затем промойте теплой проточной воде в течение 10 мин.
- Промыть дистиллированной водой, изображение с раствором эозина за 2 мин и снова промыть дистиллированной водой.
- Место в 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH и ксилола (2 раза) за 2 мин каждая обезвоживает и очистить разделы. Крепление с смолистые монтажа средних.
- Иммунофлюоресценции пятнать.
- Используйте разделы ранее полученных ткани («рулет») для окрашивания иммунофлюоресценции и подготовить крио cut разделы 7 мкм.
- Заблокировать разделы ацетон исправлена и замороженных Колон в 5,0% крыс сыворотка для 10 мин и проинкубируйте ночь с разбавленным (1/500 v/v) биотинилированным первичной крыса анти мыши F4/80 антитела. Вымойте разделы трижды в трис амортизированное saline (TBS) и проинкубируйте с стрептавидина-FITC (1: 100 v/v) в PBS/BSA (0,1% w/v) на ночь при 4 ° C.
- Мыть в подразделах TBS и пятен с 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v), для достижения контраста. Анализ изображения флуоресценции под конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов; 40 кратном куб Н2.1 фильтров с фильтром возбуждения 515-560) и рассчитывать F4/80-положительных клеток одного мощного поля.
Примечание: Используйте антитела же клон и формат при объединении в vivo ДРМ и посмертное гистология анализы как иммуногистохимия или окрашивание иммунофлюоресценции, в зависимости от намеченной цели. Для обнаружения F4/80-позитивных макрофагов в естественных условиях и ex vivoбыли использованы различные форматы.
- MPO измерения в образцах толстой кишки.
- Использование свежей получены, PBS-промыть Колон образцы или талой образца для MPO измерений. Взвесить все образцы и гомогенизации ткани литического буфера в ELISA комплекта (см. Таблицу материалов) в объеме 20 мкл буфера lysis на мг ткани.
- Sonicate 15 s (sonication частота: 20 кГц, мощность: 70 Вт) и Центрифугуйте образцы на 10 минут при 200 x g и 4 ° C.
- Использование коммерчески доступных ELISA комплекта (см. Таблицу материалы) согласно описанию производств. Проводить испытания в дубликаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка колит:
DSS-индуцированной колит является химически индуцированных мышиных модель кишечного воспаления, что напоминает человека IBD и приводит к потере веса, ректальное кровотечение, поверхностные изъязвления и повреждение слизистой оболочки в восприимчивых мышей15. Это особенно полезно для изучения вклада иммунной системы к развитию воспаления кишечного10,11. Мощно побудить colitic воспаление, мышей были постоянно осуществляется DSS на протяжении всего эксперимента. Снижение веса тела и Кала на скрытую кровь были использованы как клинические показатели воспаления. Как показано на рисунке 1A, мышей начал, потеря веса, начиная на четвертый день после индукции колит, тогда как контрольных животных, получающих воду только показал никаких существенных изменений в массы тела. Кроме того, colitic животных показали увеличение экскреции оккультной крови с калом (рис. 1B), как оценить с помощью следующих гемоккульт балльной системе: 0 (без крови), 1 (гемоккульт положительный), 2 (гемоккульт позитивные и визуальные Пелле кровотечения) и 4 ( брутто, кровотечения, кровь вокруг ануса)16. Длина толстой кишки была измерена оценить воспаления индуцированной толстой шортинг, раскрывая значительно сокращен двоеточия в colitic мышей по сравнению с управления мышей, получающих воду только (рис. 1 c). Непосредственно оценить повреждения кишечника, гистологический анализ был проведен в конце эксперимента. Количественная оценка гистологических ущерба была выполнена на толстой H & E-окрашенных разделы, используя общие основные травмы на основе степени и масштабов воспаление, повреждение склеп и процент участия17. Colitic мышей признаки тяжелое воспаление, в то время как мыши контроля, получения не DSS показали нет гистологической повреждений (рис. 1 d). Фотографии демонстрируют характерные воспалительные изменения в DSS-индуцированной колит, характеризуется разрушения эпителия архитектуры, с потерей бокаловидных клеток, склеп ущерба и изъязвления слизистой, во многом сохранились в отличие от слизистой Архитектура управления мышей18. Статистические различия между группами (n = 5 для каждой группы) были рассчитаны на дисперсионный анализ (ANOVA) после студент-Ньюман-Keuls (S.N.K.) специальная должность тест или тест Уэлча следуют игры-Хауэлл пост Специального теста в случае значительных отклонений неоднородности. P-значение < 0,05 считался значительным.
Оценка моноцитов и макрофагов набора:
Как связаны с проникновение иммунные клетки, моноциты и макрофаги, в слизистой оболочке и подслизистой толстой кишки, колит, DSS-индуцированной мы использовали immunofluorescent окрашивания для маркера моноцитов/макрофагов F4/80 для количественного определения инфильтрата. Colitic мышей, получающих DSS показали значительно повышенное количество моноцитов, внедряясь в стенке кишки по сравнению с не colitic управления мышей (рисунок 2A). Лейкоцитарной инфильтрации был дополнительно количественно с помощью immunofluorescent окрашивание нейтрофилов маркера GR1, раскрывая значительно возросшая иммиграция нейтрофилов в воспаление толстой кишки по сравнению с управления мышей (рис. 2B). Для подтверждения, MPO уровнях, отражающих оба нейтрофилов номер и воспалительной активности значительно были подняты в тканях кишечника colitic мышей (рис. 2 c). ANOVA и S.N.K. пост Специального теста были использованы для вычисления статистической значимости между группами (n = 5 для каждой группы). Статистическая значимость была установлена на уровне p < 0,05.
Системные изменения в макрофагов субпопуляции:
Моноциты мыши охватывают разнородную группу отдельных субпопуляций, которые отличаются в состоянии созревания и их способность быть набраны воспалительных сайты, где они участвуют в инициировании и увековечивая воспалительной реакции19 . Таким образом мы характеризуется анализ дифференциального выражение CD11b крови моноциты и Ly6C с помощью проточная цитометрия. Воспалительные условиях острого колита DSS мы наблюдали значительное увеличение воспалительной CD11bвысокойLy6Cвысокой моноциты по сравнению с предварительно эксперимент условий. Напротив этот сдвиг не происходит в не colitic управления мышей без DSS (рис. 3A). Данные (n = 5 для каждой группы) были проанализированы с использованием дисперсионного анализа и S.N.K. Как параметр Дополнительные суррогат для системного воспаления мы оценили присутствие F4/80-положительных клеток в селезенке colitic мышей, по сравнению с не colitic элементы управления, которые показали значительное увеличение DSS-лечение мышей (рис. 3 c).
Флуоресценции опосредованной КТ сканирования:
Мы использовали флуоресценции опосредованной томографии для измерения набора моноцитов/макрофагов и проникновение в слизистой оболочке кишечника. Флуоресцировани обозначенного антитела против мышиных F4/80 работал непосредственно визуализировать Активированные макрофаги в живых животных. Приклеенные этикетку, неспецифическая крыса IgG антитела были использованы в качестве элемента управления изотипа. Для сканирования, мышей были бритые в области живота, чтобы свести к минимуму отражение света, мех, под наркозом изофлюрановая непрерывного снабжения и изучены в ветеринарии ДРМ устройство для малых животных флуоресценции. Как показано на рисунке 4A, индукции колит, привело к значительно повышенные накопление флуоресцентные трассировщика в двоеточия colitic мышей по сравнению с не colitic управления, указывающее увеличение проникновение моноцитов и дифференциация в активных макрофагов в colitic животных. Применение неспецифических флуоресцировани обозначенного IgG не вызывают обнаружению флуоресценции ответ в живот и кишечника, ни в colitic (DSS), ни группе не colitic (вода), демонстрируя специфика зонд целевой взаимодействие антител F4/80 (рис. 4A). Представитель изображения брюшной области отображаются. Цветовой код указывает уровень интенсивности флуоресценции, который соответствует степени воспалительного инфильтрата()Рисунок 4B и 4 C).Ex vivo измерения F4/80-направленных трассирующими накопления в описаны двоеточия проверены толстой происхождение сигнала в vivo обнаружены скопления трассирующими F4/80 (Рисунок 5А и 5B). Рассчитанные суммы связанных антитела хорошо коррелирует (R2 = 0,52) с гистологически определяется количеством проникновения макрофагов (рис. 5 c и 5 D), подтверждающий что в естественных условиях изображений с конкретными Трейсеры может быть свидетельствует об активности местных заболеваний. Данные были проанализированы ANOVA и S.N.K. пост Специального теста с уровень статистической значимости на p < 0,05. Корреляция была рассчитана как линейной регрессии.
Рисунок 1 . Клинические параметры и гистологической травмы в течение острого колита DSS.
Мышей C57Bl/6 были оспорены с DSS (2% w/v) в питьевой воде на 8 дней. Контроль мышей были даны питьевой воды без DSS. Животные были умерщвлены в день 9. Приведены данные из одного эксперимента (n = 5 для каждой группы) ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). (A) относительно начальный вес представлены изменения веса. (B) крови экскреции в фекалиях, как определено Гуаяк бумаги тест (гемоккульт, 0 = отрицательный, 4 = крови макроскопически). (C) после смерти толстой кишки длиной. (D) гистологические травмы как начисленных, степень повреждения склеп и степень воспаления. Изображены представитель гистологические изображения (гематоксилин/эозином; увеличениях: 10 x (Верхняя панель), 20 x (Нижняя панель)) colitic (левой панели) или управления (правой панели) мышах. Обратите внимание, глубокие разрушения эпителия архитектуры и воспалительные инфильтраты (стрелки). Гистограмма: Оценка травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Кишечные моноцитов и макрофагов проникнуть.
DSS колит в C57BL/6 индуцированных применение DSS (2% w/v) в питьевой воде. Мышь управления получил питьевой воды в одиночку. Данные из n = 5 мышей каждой группы отображаются ± SEM. (A) Immunofluorescent визуализация макрофагов инфильтратов в слизистой оболочке. Изображены представителя изображения анти F4/80 пятнать в colitic и контроль мышей. Гистограмма: клеток/высокая мощность поле (HPF). (B) Immunofluorescent визуализация нейтрофилов инфильтрации слизистой оболочки. Изображены представителя изображения анти Gr-1 пятнать в colitic животных и элементов управления. Гистограмма: сотовый/ФВЧ. (C) концентрация MPO в толстой ткани colitic и не colitic мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Моноцит вербовка в отсеке кишечника.
Моноцитов в периферической крови от colitic мышей, а также управления мышей (n = 5 для каждой группы) были проанализированы проточной цитометрии для выражения Ly - 6C на CD11b-положительных клеток. Клетки были отсортированы по ССК и CD11b выражения. Моноциты мыши были определены как SSCнизкойCD11bвысоким клетки, и проанализированы их выражение Ly6C. (A) пропорционального изменения к воспалительные Ly6C,высокой моноциты изображены относительно условий до эксперимента (% изменения ± SEM). (B) СУИМ точка участков Ly6C выражения на SSClВЛCD11bвысоким клетки colitic животных до и после индукции колит (нижняя панели) и контроля до и после эксперимента (верхней панели). (C) Splenocytes от colitic и не colitic мышей были оценены для выражения F4/80 проточной цитометрии (средняя флуоресценции интенсивности ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Томографические визуализация макрофагов инфильтрата в мышиных колит.
ДРМ сканирует в colitic мышей и не colitic контроль осуществляется Cyanine7-конъюгированных антител против мышиных F4/80 (n = 5 для каждой группы). (A) гистограммы: Общая флуоресценции интенсивности в пмоль краска была определена в ROI и изображены ± SEM. Представитель изображения отображаются с цветом флуоресценции света, соответствующей степени воспалительного инфильтрата в мышах вводят с конкретного ПЭП (анти мыши F4/80) (B) и неспецифические управления (Крыса IgG) (C). В обоих случаях ROI одинакового размера был помещен поперечной в верхней части живота для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Ex vivo Проверка трассирующими специфичности в мышиных колит.
В естественных условиях ДРМ сканов в colitic мышей, вводится с конкретного ПЭП (анти мыши F4/80) последовали ex vivo Вселенский флуоресценции сканирует описаны кишечник, чтобы продемонстрировать толстой происхождение сигнала трассировщик полученные в vivo. Данные из двух экспериментов с в общей сложности n = 8 показаны животных. Представитель изображения отображаются с изображением в vivo ДРМ сканов colitic мышей с цветом флуоресценции интенсивности, соответствующий степени воспалительного инфильтрата (A).Флуоресценции отражения изображения explanted кишечника позволяет для выявления конкретных областей с накоплением трассирующими (B). Представитель посмертное immunofluorescent окрашивания для F4/80-позитивных макрофагов из таких районов подтверждает результаты в vivo (C). Количество проникновения макрофагов, как определяется иммунофлюоресценции окрашивание, коррелировали с в vivo измеряется трассирующими накопления (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя медицинские методы визуализации быстро эволюционировали в последние годы, мы по-прежнему ограничены в нашу способность обнаруживать воспалительных процессов или опухоли, а также других заболеваний на ранних стадиях развития. Однако это имеет решающее значение для понимания опухолевого роста, вторжения, или развития метастазов и клеточных процессов в развитии воспалительных и дегенеративных, сердечно-сосудистой и иммунологических заболеваний. Хотя традиционные методы визуализации полагаются на физических или физиологических параметров, Молекулярное воображение позволяет визуализацию конкретных молекулярных маркеров в vivo20.
Для малых животных изображений, подходов, ориентированных на радионуклидов (Инглнапример, s-эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ)), УЗИ и флуоресценции опосредованной визуализации может использоваться для визуализации конкретных молекулярные целевых структур. Использование полнометражного антител как наиболее доступных костяк трассирующими требует долговечные этикетки, как долго циркуляции раз и медленно ткани проникновения задержки времени изображения после применения трассировочных. Поэтому типичные изображений радионуклидов не подходят для изображений в vivo антитела распределения. Использование долгоживущие изотопы как Cu64 или In111 позволяет на основе антител Трейсеры но требует сложной инфраструктуры, охватывающей изотоп поколения, радиационной безопасности до и во время процедуры маркировки и экранированные животных после применения зонд. Более экономически эффективным и безопасным вариантом будет быть флуоресценции опосредованной визуализации.
Несколько в vivo imaging систем для обнаружения, Визуализация и измерение распределения Люминесцентную краску в живых животных были представлены за последние два десятилетия21. Большинство систем позволяют быстрое плоскостное подходит для изображений поверхностным поражением. Из-за поглощения и рассеяния, сигналы глубоко в ткани уклониться от плоскостное. Наиболее известных решение для этой проблемы является флуоресценции томография22. На основе математического моделирования, сигнала изображения исправляется для рассеивающих и света поглощения и виртуальный 3D набор данных рассчитывается из круга проекции набора8. Алгоритм обеспечивает полностью количественных данных, позволяя оценки трассировщик концентрации в отдельных регионах представитель Целевой концентрация/выражение23. Соответствующие ограничения ДРМ связано с бедных пространственного разрешения по сравнению с анатомической методы обработки изображений, который может зависящ на желаемый целевой компромисс распределение молекулярного информации для определенных анатомических структур. Другое ограничение заключается в глубины ограничения проникновения света в ткани, который требует использования преобразователей поглощающих и флуоресцирующих в красном NIR спектральный диапазон23.
Недавно представила изображений модальность, которая сочетает в себе преимущества морфологическое УЗИ и возможность получения молекулярной информации от флуоресценции изображений является оптико изображений. Предварительные результаты ранних исследований показывают, что-несмотря на необходимость дальнейшего технические уточнения оптико изображений имеет большие перспективы для Молекулярное воображение и потенциальных трансляционная приложений24.
Набор лейкоцитов к кишечной стенки представляет собой решающий шаг в начало и увековечение IBD, как набор воспалительных клеток на сайт инфекции или воспаления в многих заболеваний иммунной системы, как аутоиммунное заболевание, инфекции, сосудистых заболеваний, опухолей и многие более25. Моноцит активации и проникновение в слизистой оболочке кишечника является важным шагом в патогенезе IBD, ингибирование проникновение моноцитов, организованные chemokines и взаимодействия молекулы адгезии Интегрин клеточного, является многообещающим терапевтических подход к12,26. Таким образом мониторинг лейкоцита людьми на сайт воспаления имеет решающее значение в развитии новых терапевтических параметров визуализировать противовоспалительные эффекты исследуемых препаратов. Это может быть специальный интерес, потому что агенты ориентации лейкоцита людьми были разработаны, и некоторые антитела анти Интегрин уже доступны для терапии IBD, в то время как дополнительные компоненты будут доступны в ближайшем будущем26. Vedolizumab, гуманизированные моноклональные антитела против Субблок Интегрин кишки конкретных α4β7 и Etrolizumab, которая связывает β7 Субблок кишечного α4β7 и αEβ7 Интегрин гетеродимерами, были утвержденные27,28. Другие агенты (например, ПФ-00547659 MAdCAM-1 и модуляторы рецептора сфингозин-1-фосфата (S1P) такие как Ozanimod) в настоящее время проходят оценку для лечения IBD29,30.
При выполнении ДРМ, возможные изменения методики включают в себя выбор комбинаций различных трассировщик цель, а также объединения ДРМ с структурные подходы к компенсации для бедных пространственное разрешение изображений. Широкий спектр комбинаций зонд целевой создана и коммерциализации. Для конкретных проектов, маркировки пользовательских антител может быть производится с использованием коммерческих маркировки наборы и выше протокол. В зависимости от антител или меньше пептид, выбран в качестве таргетинга остаток коммерческие поставщики предлагают широкий спектр различных меток. Рассмотреть нужный краситель, в зависимости от применения: для изображений, краска в НДК спектра глубокой ткани (например, Cy7, λex / ет 750/780 нм) может быть хорошо подходит, в то время как общая яркость и эффективного свет поставок красителей действующие в вблизи видимой области спектра (например, GFP аналогов) может быть предпочтительным. Практически все красители могут быть получены как активного Эстер метку лизин остатков белков, а также с альтернативными привязки постановление, например малеинимидов для привязки хвоща или биотина для маркировки белков, оснащенных конкретных маркировки теги31 . Выбор лейбла не изменяет принцип протокол, но требует лишь незначительные изменения маркировки процедуры и имеет важное значение для хорошего результата обработки изображений. Еще один привлекательный модификации для преодоления ограничений в пространственное разрешение является объединить ДРМ с КТ или МРТ, позволяя Аннотация анатомических структур с молекулярной информации.Структурная информация может либо быть приобретены последовательно как априорной информации или одновременно, который требует гибрид изображений инструментария32,33.
Особого внимания заслуживают некоторые шаги протокола. Как эта техника может быть адаптирована для множества флуоресцентный photoprobes, что целевой целый ряд конкретных молекул представителя различных молекулярных процессов, важно, чтобы для достаточного распространения зондов и обогащения в нужного целевого региона. Идеальный момент для визуализации элемен зонд целевой комбинации. Например антитела против опухоли рецепторов может быть под влиянием уровень распространения опухоли, поглощение и метаболизм в печени, и возможных побочных реакций иммуногенность34. Также рассмотреть соответствующие элементы управления для конкретных изображений подходов. Конкретные Трейсеры всегда должны проверяться против изотипа элементы, отражающие перфузии эффекты и неспецифическим привязки (например, Fc рецептор опосредованный привязки). Цель отрицательных животных может служить дополнительный элемент управления для специфики трассирующими, если существуют такие модели нокаут. Кроме того блокируют экспериментов могут выполняться доказать Специфичность антител целевого взаимодействия35.
Ниже приводятся важнейшие шаги, касающиеся практических аспектов процедуры: (1) тщательно определить DSS концентрации используется, как восприимчивость DSS может варьироваться между различными мыши штаммов и производит/пакеты36. (2) тщательно выберите зонд целевой комбинаций. (3) позволяют около 5 мин время сканирования для достаточной проверки всей брюшной полости. Оптимальное время точки трассировки приложения и процедурой обработки изображений необходимо тщательно определяться для трассировочного накопления в регионе желаемому. Для кишечных F4/80 обнаружения в мышиных колит обозначенное антитело следует вводить 24 ч до начала сканирования. (4) как неспецифическим лейбл накопления может произойти (например, в печени), важно называть ROI на соответствующий целевой ткани, поместив соответствующие измерительные инструменты. Кроме того достаточно элементов для неспецифической трассирующими распределения должны быть включены рассмотреть неспецифических изотипа элементы управления исключать перфузии эффекты и нокаут или блокирование исследования для проверки взаимодействия трассировщик целевой.
Типичные источники ошибок, связанных с сканирования процедуры и данных восстановления включают неправильное положение животных, сканирования поля и времени экспозиции. При позиционировании животного, флуоресцирующего поражения должно быть окружено ткани со всех сторон, чтобы свести к минимуму шум реконструкции. Воздушные пузырьки в ловушке между животным и передней стеклянной пластиной изображений кассету также может увеличить уровень шума и должны быть удалены путем перемещения животных слегка. Над - или недоэкспозицией изображения может потребовать повторного сканирования с параметрами изменение воздействия, которые можно найти в окне сканирования (отражения изображения блока: корректировки время передней светодиод интенсивность и воздействия). При объединении в естественных условиях на основе антител ДРМ измерений с посмертной гистологических анализов, например иммуногистохимия или immunofluorescent окрашивание, следует рассмотреть использование антител же клон и формат. Кроме того при выполнении повторяющихся измерений ДРМ в том же животных, такие же форматы и клоны должны использоваться для предотвращения возможной перекрестной реактивности или ориентации различных эпитопов.
Взятые вместе, флуоресценции опосредованной молекулярных томография позволяет повторяющихся мониторинга течения заболевания и лежащие в основе патофизиологических процессов. Он может быть применен к множество биомедицинских исследований и может быть полезным для ускорения тестирования на наркотики или как конечную цель в индивидуальной терапии. FMT-таргетинг F4/80-выражая макрофагов в моделях воспаления обеспечивает ценный инструмент неинвазивной визуализации и количественно инфильтрации и накоплением воспалительных клеток также демонстрируя хорошую корреляцию с обычными индикация.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жа Соня Dufentester, г-жа Elke Вебер и миссис Klaudia Niepagenkämper за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al.
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
