Summary
Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.
Abstract
Lymfkliertest modellen van ziekte is onontbeerlijk voor wetenschappelijk onderzoek. Echter zijn veel diagnostische hulpprogramma's zoals endoscopie of tomografische imaging niet routinematig gebruikt in diermodellen. Conventionele experimentele uitlezingen is vaak afhankelijk van post-mortem en ex vivo analyses, die intra individuele follow-up onderzoeken te voorkomen en verhogen het aantal studie dieren nodig. Fluorescentie-gemedieerde tomografie kan de niet-invasieve, repetitieve, kwantitatieve, driedimensionale beoordeling van fluorescerende sondes. Het is hoogst-gevoelig en staat het gebruik van moleculaire makers, die het mogelijk voor de specifieke detectie en karakterisatie van verschillende moleculaire targets maakt. In het bijzonder vertegenwoordigen gerichte sondes een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van activering en eiwit expressie van genen in de ontsteking, auto-immune ziekte, infectie, vaatziekten, cel migratie, tumorigenesis, enz. In dit artikel bieden we stapsgewijze instructies op deze geavanceerde imaging technologie voor de in vivo detectie en karakterisering van ontsteking (dat wil zeggen, F4/80-positieve macrofaag infiltratie) in een veelgebruikte lymfkliertest model van darmontstekingen. Deze techniek kan ook worden gebruikt in andere onderzoeksterreinen, zoals immuun cel of een cel van de stam bijhouden.
Introduction
Dierlijke modellen worden veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, en vele niet-invasieve procedures bestaan monitor ziekte activiteit en vitaliteit, zoals de kwantificering van veranderingen in het lichaamsgewicht of de analyse van bloed, urine en ontlasting. Echter, deze zijn slechts indirecte surrogaat-parameters die ook onderhevig aan inter-individuele variabiliteit zijn. Ze moeten regelmatig worden aangevuld met post-mortem analyse van weefsel specimen, waardoor seriële observatie op repetitieve tijdstippen en directe observatie van fysiologische of pathologische processen in vivo. Opgedoken verfijnde beeldvormingstechnieken van de kleine dieren, met inbegrip van cross-sectionele imaging en optische beeldvorming, endoscopie, wat mogelijk maakt de directe visualisatie van deze processen en maakt het ook mogelijk voor herhaalde analyses van de dezelfde dieren1 , 2 , 3. bovendien de mogelijkheid om herhaaldelijk volgen verschillende staten van ziekte in hetzelfde dier het aantal dieren nodig, die misschien wel wenselijk is vanuit een oogpunt van dierenethiek kan verkleinen.
Verscheidene verschillende optische beeldvormingstechnieken bestaan voor in vivo fluorescence imaging. Oorspronkelijk werkte confocal imaging te bestuderen van oppervlakte- en ondergrond fluorescerende gebeurtenissen4,5. Onlangs, echter, tomografische systemen waarmee voor kwantitatieve drie-dimensionale weefsel evaluaties zijn ontwikkelde6. Dit is bereikt door de ontwikkeling van fluorescerende sondes die licht in het nabij-infrarood (NIR) spectrum, het aanbieden van de laag absorptie, gevoelige detectoren en monochromatisch lichtbronnen7uitstoten. Terwijl de traditionele cross-sectioning beeldvormingstechnieken, zoals computertomografie (CT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of echografie (VS), meestal afhankelijk van fysieke parameters en visualiseren van morfologie, kan optische beeldvorming bieden aanvullende informatie op onderliggende moleculaire processen sondes met behulp van endogene of exogene TL8.
Vooruitgang in moleculaire biologie hebben bijgedragen tot het vergemakkelijken van de generatie van slimme en gerichte fluorescerende moleculaire sondes voor een toenemend aantal doelstellingen. Bijvoorbeeld kunnen receptor-gemedieerde opname- en distributie in een bepaald doelgebied worden gevisualiseerd met behulp van carbocyanine afgeleide gelabelde antilichamen9. De overvloed aan beschikbare antilichamen, die kan worden aangeduid als specifieke verklikstoffen in anders ontoegankelijke gebieden van het lichaam, biedt ongekende inzichten in de moleculaire en cellulaire processen in modellen van tumorvorming en neurodegeneratieve, cardiovasculaire, immunologische en inflammatoire ziekten7.
In deze studie beschrijven we het gebruik van fluorescentie-gemedieerde tomografie in een lymfkliertest model van colitis. Dextran natriumsulfaat (DSS)-geïnduceerde colitis is een standaard chemisch geïnduceerde muismodel van darmontstekingen strekking inflammatory bowel disease (IBD)10. Het is vooral handig voor de beoordeling van de bijdrage van het aangeboren immuunsysteem aan de ontwikkeling van darm ontsteking11. Aangezien de aanwerving, activering en infiltratie van monocyten en macrofagen vertegenwoordigen cruciale stappen in de pathogenese van IBD, zijn visualisatie van hun aanwerving en de kinetiek van infiltratie essentieel voor de monitoring, bijvoorbeeld het effect van potentiële therapeutische stoffen in een preklinische instelling12. We beschrijven de inductie van DSS colitis en tonen de tomografie-gemedieerde karakterisering van macrofaag infiltratie in de mucosa van de darm met behulp van fluorescentie moleculaire tomografie voor de specifieke visualisatie van de monocyt/macrofaag markering F4/80 13. Daarnaast illustreren we ondersteunende en aanvullende procedures, zoals het antilichaam etikettering; de experimentele opzet; en analyse en interpretatie van de verkregen beelden, in correlatie met conventionele uitlezingen zoals ziekte activiteit indexen, stromen cytometry en histologische analyse en immunohistochemistry. We bespreken de beperkingen van deze techniek en vergelijkingen met andere beeldvormende modaliteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen volgens de Duitse dier bescherming wet (Tierschutzgesetz).
1. materialen en experimentele opstelling
- Verzorging van de dieren.
- Het gebruik van geslacht en leeftijd-zoekwoorden muizen van een DSS-gevoelige stam (b.v., C57BL/6) op 20-25 g lichaamsgewicht.
- Plan minstens vijf of meer muizen per experimentele groep en huis de muizen volgens lokale dierenverzorgers richtlijnen.
- Bieden een standaard knaagdier chow dieet en gesteriliseerde met autoclaaf drinkwater ad libitum.
- De standaard chow verwijderen en vervangen door alfalfa-vrije chow ten minste drie dagen vóór het scannen ter vermindering van de endoluminal auto-fluorescentie.
- Inductie van acute DSS-geïnduceerde colitis.
- Los 2 g van DSS (moleculair gewicht ~ 40.000 Da) in 100 mL gesteriliseerde met autoclaaf drinkwater te verkrijgen van een 2% (w/v oplossing).
- Vul de drinken levering van de muizen uitsluitend met de DSS-oplossing en schatten 5 mL vloeistof per muis per dag. De dezelfde drinkwater zonder DSS naar het besturingselement muizen10voorzien.
Opmerking: Controleer de muizen dagelijks tot het einde van het experiment. Euthanaseren van de muizen die groter is dan 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht verliezen of dat stervende geworden (dat wil zeggen, aanhoudend gebogen houding, verminderde beweging, gearbeid ademhaling, sterk opgaand vacht) volgens de richtsnoeren van de lokale toepassing op dier welzijn.
- Voorbereiding van fluorescentie-gemedieerde tomografie.
- Label de gewenste antilichaam (bijvoorbeeld rat-antimuis F4/80) met fluorescentie kleurstof (bijvoorbeeld Cyanine7, λexcitatie: 750 nm, λemissie: 776 nm) zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Dialyze gezuiverde antilichaam in een passende dialyse membraan (grootte porie < 50-100 kDa) tegen 1 L van 0,15 M natriumchloride voor ten minste 2 uur of 's nachts.
- Het antilichaam overbrengen door 1 liter 0,1 M NaHCO3 en dialyze voor ten minste 2 uur.
- Los de benodigde hoeveelheid fluorescente kleurstof in dimethylsulfoxide (DMSO) (10.8 µL/mg van antilichaam) en toevoegen aan de antilichaam-oplossing. De fluorescente kleurstof in 20-fold molaire overmaat gebruiken om een kleurstof-naar-eiwitverhouding van 1:3.
- Incubeer in het donker bij 4 ° C voor 1 h. labelloze antilichaam door dialyse tegen 1 L van 0,15 M natrium of met behulp van een demineralisatie PD-10-kolom verwijderen en op te lossen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor in vivo toepassing.
- Bepaal de definitieve antilichaam concentratie en labeling verhouding door spectrofotometrie.
- Meten van de eiwitconcentratie op een opname van 250-330 nm en overwegen extra absorptie door de kleurstof. Corrigeren van de maximale extinctie op 280 nm (eiwit) met 11% van de maximale extinctie bij 750 nm (volgende stap) voor het labelen van de Cyanine7.
- Meten van een verdunning van de stof (meestal 1:10) op 250-800 nm en uitpakken van de concentratie van Cyanine7 bij 750 nm.
- Bepalen van de kleurstof-naar-eiwitverhouding als: kleurstof/antilichaam = maximale extinctie bij 750 nm / 200.000 / (maximale extinctie op 280 nm - 0.11 x max absorptie bij 750 nm) / 170.000.
- Bewaar de antilichaam-oplossing bij 4 ° C en het schild van licht te vermijden bleken vóór injectie.
- Laden het volume van de oplossing nodig antilichaam in een steriele spuit vóór injectie en schild van licht totdat het wordt gebruikt.
- Het bepalen van de optimale timing van sonde injectie en de scanning procedure, afhankelijk van de tracer farmacokinetiek.
- Anesthetize van de muizen met behulp van 1,5 tot 2,5% ingeademd Isofluraan in zuurstof of plaats ze veilig in een speciale afdekking voor de staart veneuze injectie van de gelabelde antilichamen.
- Voor full-length antilichamen, injecteren de gelabeld antilichaam ten minste 24 uur vóór het scannen, zoals anti-muis F4/80 macrofaag visualisatie in lymfkliertest colitis. Intraveneus injecteren van muizen (i.v.) via de staart ader met gelabeld antilichaam in een bedrag dat overeenkomt met 2.0 nmol van kleurstof.
- Gebruik even aangeduid aspecifieke antilichamen (bijvoorbeeld IgG rat of een ander isotype overeenkomt met het primaire antilichaam erfgoed) als een besturingselement isotype in doses gelijkwaardig zijn aan die van de specifieke sonde.
Opmerking: De resultaten van in vivo scant na injectie van de controle samengestelde kan dienen als referentie voor de interpretatie van de specifieke sonde imaging gegevens. - Gebruik een elektrisch scheerapparaat te scheren van de dieren bont in de abdominale regio om licht reflectie en absorptie te minimaliseren.
- Label de gewenste antilichaam (bijvoorbeeld rat-antimuis F4/80) met fluorescentie kleurstof (bijvoorbeeld Cyanine7, λexcitatie: 750 nm, λemissie: 776 nm) zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Dialyze gezuiverde antilichaam in een passende dialyse membraan (grootte porie < 50-100 kDa) tegen 1 L van 0,15 M natriumchloride voor ten minste 2 uur of 's nachts.
2. technische uitrusting
- Gebruik een veterinaire fluorescentie-gemedieerde tomografie (FMT) apparaat voor kleine dieren fluorescentie ( Figuur 4).
- Een nieuwe studie voor elk project maken door te klikken op de "nieuwe studie" knop en vermeld in de beschrijving van de studie van de relevante traceurs, met inbegrip van de imaging parameters en doses voor toekomstig gebruik.
- Binnen deze studie studiegroepen volgens de respectieve studie ontwerp (bijvoorbeeld voor specifieke tracer en aspecifieke isotype beheersing) te maken door te klikken op de "nieuwe studiegroep" knop. Elke studiegroep met de respectieve aantallen dieren uit te rusten.
- Kalibreer het systeem voor de tracer constructies.
- De kalibratie voor elke batch van verklikstoffen om te normaliseren voor de variatie in labeling en kwantitatieve meting van OI gegevens uitvoeren
- Volg de begeleiding van de fabrikant van het instrument voor het kalibreren van elke individuele systeem; selectie 'toevoegen nieuwe tracer', bij het systeem zal het verstrekken van een gids door de stappen. Bieden de verdunning van de toegepaste antilichaam-oplossing en de berekende absolute concentratie van tracer in de sonde.
- Voor FMT, gebruik een phantom weefsel nabootsen van gedefinieerde dikte en absorptie-eigenschappen (lijkend op vitale weefsels) en vul deze met een specifieke volume van de oplossing van de antilichaam gebruikt. Meet dit op het FMT-apparaat.
Opmerking: Het systeem gebruikt de referentiemeting van de meegeleverde sonde, samen met de gegeven concentratie, voor de berekening van de absolute tracer concentraties van toekomstige in vivo metingen.
- Gebruik van een verwarmbaar onderzoek cassette met een temperatuur van 42 ° C.
Opmerking: Dit voorkomt dat de muizen steeds hypothermic tijdens het onderzoek.
3. dierlijke anesthesie
- Gebruik van een continue stroom van 1,5-2% vol % Isofluraan ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) en 1,5 L O2/min aan de anesthetize van de muizen.
4. fluorescentie-gemedieerde tomografie Scan
Opmerking: Passen de volgende gegevens, die specifiek voor de FMT-systeem dat wordt gebruikt in deze zijn studie (Zie de Tabel van materialen) in voor alternatieve fluorescentie reflectiecoëfficiënt imaging-apparaten of FMT systemen, zo nodig.
- Plaats de narcose muis op zijn rug in de onderzoek-cassette.
- De scanning procedure uitvoeren.
- Plaats de cassette in de imaging systeem en sluit onmiddellijk, zodat ononderbroken anesthesie. Selecteer de passende steekproef van de studiegroep eerder hebt gemaakt. De door de overheid gereguleerde tracer selecteren in het dropdown-menu om ervoor te zorgen dat de waarden voor tracer concentratie op de juiste manier zijn berekend.
- Verwerven van fluorescentie reflectie afbeelding op de juiste golflengte (720 nm voor de Cyanine7) voor de scan planning en overzicht het scannen gebied door te klikken op de knop "verwerven afbeelding".
- Zie dat het scan-veld wordt weergegeven als een overlay op de fluorescentie reflectie afbeelding. Aanpassen aan de regio van belang (b.v., dubbele punt of buik), het vermijden van lucht of gebieden van resterende bont. Afhankelijk van het doel van de afbeelding, stel het aantal afbeelding gegevenspunten binnen het scannen gebied door te kiezen uit de grof middellange en prima resolutie van de scan-veld in het menu aan de rechterkant.
Opmerking: Houd er rekening mee dat een veld fijne scan beter ruimtelijke resolutie ten koste van een aanzienlijk langer scannen tijd kan bieden. - Gegevens/Beeldacquisitie bij de geselecteerde golflengte starten door te klikken op "scan".
Opmerking: De tijd van de scan voor een middellange-fijn-scan van de gehele buik worden ongeveer 5 min; in deze tijd, elk gegevenspunt wordt afzonderlijk verlicht door de excitatie-laser en de resulterende fluorescentie wordt vastgelegd. - Verwijderen van het dier uit de imaging cassette aan het einde van de scan en laat het dier te herstellen volledig alvorens het terug in de kooi.
- Herhaal de FMT indien noodzakelijk op verschillende tijdstippen tijdens het experiment (bijvoorbeeld dagen 0, 5 en 9-10 (einde van het experiment)), maar vind de accumulatie van antilichamen in het lichaam, daarom het verhogen van het signaal van de fluorescentie achtergrond.
5. na aftasten
- Plaatst u de muisaanwijzer in een aparte kooi op een papieren handdoek onder een opwarming van de aarde lamp van rood-licht en controleren de muis voor tekenen van ongemak of leed tot volledig herstel. Plaats de muis terug in zijn respectieve kooi wanneer volledig wakker.
- Euthanaseren de muizen aan het einde van het experiment door de levering van CO2 aan de isolator bij een dosis van 100% (v/v), 100 vol % en 3 L/min. Vooraf vult niet de kamer met CO2, aangezien een plotselinge blootstelling aan hoge concentraties CO2 nood zou kunnen veroorzaken. Controleer of dood nadat de muis is gestopt met ademen door een latere secundaire modus van euthanasie zoals snelle cervicale dislocatie.
- De dikke darm door abdominale laparotomy explant en uitvoeren van een scan ex vivo van het transplanteren van de dikke darm, zoals uitgelegd in stappen 4.2.1 - 4.2.4. Open elke dikke darm overlangs met behulp van Metzenbaum chirurgische schaar en spoel met zoutoplossing voordat voorbereiden voor verdere analyse.
- Gebruik een scalpel te snijden een fragment van 0,5 cm van de distale dubbelpunt en plaatst u deze onmiddellijk in een 1.5-mL cryogene buis. Bevriezen in vloeibare stikstof en winkel bij-70 ° C tot verder gebruik (b.v.,myeloperoxidase (MPO) metingen).
- Gebruik een houten stok en roll-up de resterende lengterichting geopend dubbele punt van de distale als proximale einde, met de mucosa naar buiten ("Swiss roll-techniek"), voor histologisch analyses. Plaats de voorbereiding in een hechtmiddel (Zie de Tabel van materialen) en bevriezen bij-80 ° C14.
6. gegevens wederopbouw en interpretatie
- Gebruik het gereedschap van de wederopbouw van de respectieve imaging software 3D om kaarten te maken van de fluorescentie-verdeling van de ruwe gegevens van de beeldvorming; scans worden automatisch toegevoegd aan de wederopbouw hulpmiddel, wanneer bij het scannen, de functie "add to wederopbouw wachtrij" is geselecteerd.
- Selecteer anders, de scans van het dropdown menu onder de respectieve studie en studiegroep, met de rechtermuisknop op de scan, en kies "toevoegen aan wederopbouw."
- Voor verdere analyse, een gegevensset in de analysesoftware te laden. Van het dropdown menu in de bovenste balk, selecteer de respectievelijke studie en selecteer vervolgens de study group en het individuele dier in het menu aan de rechterkant; alle scans uitgevoerd voor dit dier getoond. Selecteer de juiste scan en klik op 'laden'.
Opmerking: De 3D reconstructie van de verdeling van de controlepijlen verschijnt aan de linkerkant als een overlay van de aanvankelijk verkregen fluorescentie reflectie afbeelding. Het model kan worden gedraaid en vergroot gemakkelijker kunt analyseren. - Foci van aspecifieke label accumulatie (bijvoorbeeld lever- of urine blaas) op gereconstrueerde 3D-kaarten herkennen en onderscheiden van onderzoeken weefsels (bijvoorbeeld darm of darm).
- Selecteer in de bovenste balk, het meest geschikt is voor de doelgroep ROI-vorm. Label doelweefsel als regio's van belang (ROI) door het plaatsen van de respectieve meetinstrumenten in de software van de analyse; de software voorziet een intensiteit van de fluorescentie de ROI, evenals (pico-) molaire hoeveelheden de tracer dat de scan is gekalibreerd voor.
- Selecteer de totale hoeveelheid tracer in de passende ROI, genormaliseerd voor de grootte van de ROI, als het meest geschikte equivalent voor de evaluatie van ziekte activiteit in correlatie met de inflammatoire infiltreren (histologie).
Opmerking: Andere kenmerken van de ROI kunnen worden gekozen als geschikt zijn als vertegenwoordiger van het specifieke model.
7.Ex Vivo Analyses
- De Haematoxyline en eosine-kleuring en immunofluorescentie kleuring.
- Deparaffinize secties door ze te plaatsen in 70% ethanol (EtOH) gedurende 2 minuten; spoel daarna met gedestilleerd water. Vlek met haematoxyline oplossing gedurende 5 minuten en daarna afspoelen met warm leidingwater voor 10 min.
- Spoelen met gedistilleerd water, counterstain met eosine oplossing gedurende 2 minuten, en spoel opnieuw met gedestilleerd water.
- Plaats in 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH en xyleen (2 keer) gedurende 2 minuten elke uitdrogen en schakelt u de secties. Mount met harsachtige montage medium.
- Immunofluorescentie kleuring.
- Gebruik van de eerder verkregen weefselsecties ("Swiss roll") voor immunofluorescentie kleuring en bereiden cryo-cut secties 7 µm.
- Blokkeren van aceton-fixed en bevroren dubbelpunt secties in 5,0% rat serum voor 10 min en na een nacht bebroeden met verdunde (1/500 v/v) biotinyleerd primaire rat anti-muis F4/80 antilichaam. Wassen van de secties driemaal in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en incubeer met daar-FITC (1:100 v/v) in PBS/BSA (0,1% w/v) overnachting bij 4 ° C.
- Wassen van de secties in TBS en vlek met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/v) om contrast. Analyseren van de beelden van de fluorescentie onder een confocal microscoop (Zie de Tabel van materialen, 40 x vergroting; filter kubus N2.1 met excitatie filter 515-560) en de F4/80-positieve cellen per high-power veld tellen.
Opmerking: Overweeg de antilichamen van dezelfde kloon en opmaak bij het combineren van in vivo FMT en post mortem histologie analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of immunofluorescentie kleuring, afhankelijk van het beoogde doel. Voor de detectie van F4/80-positieve macrofagen in vivo en ex vivo, werden verschillende formaten gebruikt.
- MPO metingen in monsters van de dikke darm.
- Gebruik verkregen vers, PBS-gespoeld dubbelpunt monsters of ontdooide specimen voor MPO metingen. Weeg alle monsters en meng het weefsel in lysis-buffermengsel waarin de ELISA kit (Zie de Tabel van materialen) op een volume van 20 µL van lysis buffer per mg van weefsel.
- Bewerk ultrasone trillingen ten voor 15 s (ultrasoonapparaat frequentie: 20 kHz, macht: 70 W) en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 200 x g- en 4 ° C.
- Gebruik een verkrijgbare ELISA kit (Zie de Tabel van materialen) volgens de beschrijving van de fabrikanten. Uitvoeren van de test in duplicaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van Colitis:
DSS-geïnduceerde colitis is een chemisch geïnduceerde lymfkliertest model van intestinale ontsteking die lijkt op de menselijke IBD en leidt tot verlies van het gewicht, rectale bloedingen, oppervlakkige ulceratie en mucosal schade in gevoelige muizen15. Het is met name nuttig zijn te onderzoeken van de bijdrage van het aangeboren immuunsysteem aan de ontwikkeling van darmontstekingen10,11. Om krachtig colitic ontsteking, muizen werden voortdurend DSS toegediend gedurende het gehele experiment. Afnemende lichaamsgewicht en fecale occult bloed werden gebruikt als klinische indexcijfers van de ontsteking. Zoals blijkt uit figuur 1A, begon muizen afvallen vanaf dag vier na de inductie van colitis, overwegende dat de controledieren ontvangen water alleen toonde geen significante veranderingen in lichaamsgewicht. Daarnaast colitic dieren toonde verhoogde uitscheiding van occult bloed met de ontlasting (figuur 1B), zoals beoordeeld met behulp van de volgende hemoccult scoring systeem: 0 (geen bloed), 1 (hemoccult positief), 2 (hemoccult positieve en visuele pellet bloedend) en 4 () bruto bloeden, bloed rond anus)16. Lengte van de dikke darm werd gemeten om te evalueren van de ontsteking geïnduceerde Colon verkorting, onthullend aanzienlijk verkorte dubbele punten in colitic muizen ten opzichte van de controle muizen ontvangen water alleen (Figuur 1 c). Om te beoordelen direct Colon schade, werd histologisch analyse uitgevoerd aan het einde van het experiment. Een kwantitatieve beoordeling van histologische schade werd uitgevoerd op Colon H & E gebeitste secties met behulp van een algemene schade kern op basis van de graad en de omvang van ontsteking, crypt schade en percentage betrokkenheid17. Colitic muizen toonde tekenen van ernstige ontsteking, terwijl controle muizen ontvangen geen DSS geen histologische schade (Figuur 1 d toonde). De beelden tonen karakteristiek ontstekingsreactie in de DSS-geïnduceerde colitis, gekenmerkt door de vernietiging van epitheliale architectuur, met het verlies van goblet cellen, crypt schade en cutane ulceratie, in tegenstelling tot de grotendeels bewaard gebleven mucosal architectuur in controle muizen18. Statistische verschillen tussen de groepen (n = 5 per groep) werden berekend door variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Student-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc testen of door Welch's test gevolgd door Games-Howell post hoc test in geval van aanzienlijke afwijking van heterogeniteit. Een p-waarde van < 0.05 werd beschouwd als een belangrijke.
Beoordeling van monocyt en Macrophage werving:
DSS-geïnduceerde colitis is geassocieerd met de infiltratie van immuuncellen, zoals monocyten en macrofagen, in de mucosa en de submucosa van het colon, we gebruikten immunefluorescentie kleuring voor de monocyt/macrofaag marker F4/80 te kwantificeren van de infiltreren. Colitic muizen ontvangen van DSS bleek aanzienlijk verhoogde aantallen monocyten infiltreert in de wand van de dikke darm ten opzichte van niet-colitic control muizen (figuur 2A). Leukocyten infiltratie was bovendien gekwantificeerd aan de hand immunefluorescentie kleuring voor de neutrofiele marker GR1, onthullen de aanzienlijk verhoogde immigratie van neutrofielen in het ontstoken dikke darm in vergelijking met controle muizen (figuur 2B). Om te bevestigen, MPO waren niveaus als gevolg van beide neutrofiele nummer en inflammatoire activiteit aanzienlijk verhoogd in het weefsel van de dikke darm van colitic muizen (figuur 2C). ANOVA en S.N.K. post hoc test werden gebruikt voor de berekening van de statistische significantie tussen de groepen (n = 5 per groep). Statistische significantie werd vastgesteld op p < 0.05.
Systemische veranderingen in Macrophage subpopulatie:
Muis monocyten omvatten een heterogene groep van verschillende subpopulaties die in rijping staat en hun vermogen om te worden aangeworven naar inflammatoire sites verschillen, waar zij deelnemen initiëren en bestendigen van de ontstekingsreactie19 . Daarom we bloed monocyten gekenmerkt door het analyseren van de differentiële expressie van CD11b en Ly6C met behulp van stroom cytometry. Onder inflammatoire voorwaarden van acute DSS colitis vastgesteld we hebben een aanzienlijke toename inflammatoire CD11bhogeLy6Choge monocyten ten opzichte van pre experiment voorwaarden. Deze verschuiving daarentegen niet optreden in niet-colitic control Muizen zonder DSS (figuur 3A). De gegevens (n = 5 per groep) zijn geanalyseerd met ANOVA- en S.N.K. Wij beoordeeld als een parameter van de extra surrogaat voor systemische ontstekingen, de aanwezigheid van F4/80-positieve cellen in de milt van colitic muizen in vergelijking met niet-colitic besturingselementen, waaruit bleek een aanzienlijke toename van de DSS-behandelde muizen (Figuur 3 c).
Fluorescentie-gemedieerde tomografie Scan:
We gebruikten fluorescentie-gemedieerde tomografie monocyt/macrofaag werving en infiltratie in de mucosa van de darm te meten. Een fluorescentie-gelabeld antilichaam tegen lymfkliertest F4/80 werkte direct visualiseren geactiveerde macrofagen in levende dieren. Gelabelde, aspecifieke rat IgG antilichamen werden gebruikt als het isotype-besturingselement. Voor het scannen, waren muizen in de abdominale regio om te minimaliseren van licht reflectie door de vacht geschoren, verdoofd door continue Isofluraan levering en onderzocht in een veterinaire FMT apparaat voor kleine dieren fluorescentie. Zoals aangegeven in figuur 4A, de inductie van colitis leidde tot een aanzienlijk verhoogde accumulatie van fluorescerende tracer in de dubbele punten van colitic muizen in vergelijking met niet-colitic besturingselementen, geven een toename monocyt infiltratie en differentiatie in actieve macrofagen in colitic dieren. De toepassing van een aspecifieke fluorescentie-geëtiketteerden IgG niet wekken een reactie van de detecteerbare fluorescentie in de buik en darm, noch in de colitic (DSS) noch de Fractie van de niet colitic (water), demonstreren de specificiteit van de sonde-target interactie van het antilichaam van de F4/80 (figuur 4A). Representatieve beelden van de abdominale regio worden weergegeven. De kleurencode geeft het niveau van intensiteit van de fluorescentie, die correspondeert met de mate van inflammatoire infiltreren()figuur 4B en 4 C).Ex vivo metingen van F4/80-regie tracer accumulatie in transplanteren dubbele punten gecontroleerd de Colon oorsprong van het signaal in vivo gedetecteerd van F4/80 tracer accumulatie (figuur 5A en 5B). Berekende bedragen van afhankelijke antilichaam goed gecorreleerd (R2 = 0.52) met een histologisch bepaald aantal infiltreren macrofagen (figuur 5C en 5 D), waarin wordt bevestigd dat in vivo imaging met specifieke traceurs kunnen kenmerkend voor plaatselijke ziektebestrijdingscentra activiteit. Gegevens zijn geanalyseerd met ANOVA en S.N.K. post hoc test met een statistische significantieniveau ingesteld op p < 0.05. De correlatie werd berekend door lineaire regressie.
Figuur 1 . Klinische parameters en histologische schade in de loop van acute DSS colitis.
C57BL/6 muizen werden uitgedaagd met DSS (2% w/v) in het drinkwater voor 8 dagen. Controle muizen kregen drinkwater zonder DSS. Dieren werden euthanized op dag 9. Gegevens uit één experiment getoond worden (n = 5 per groep) ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). (A) veranderingen in lichaamsgewicht worden gepresenteerd ten opzichte van het oorspronkelijke gewicht. (B) bloed uitscheiding in de ontlasting, zoals bepaald door de guaiac papier test (hemoccult, 0 = negatief, 4 = bloed macroscopisch). (C) Post-mortem dubbelpunt lengte. (D) histologische letsel als beoordeeld door de mate van schade van de crypte en de mate van ontsteking. Representatieve histologische beelden getoond worden (haematoxylin/eosine-kleuring; vergrotingen: 10 x (bovenste deelvenster), 20 x (lagere paneel)) van colitic (linker panelen) of besturingselement (juiste panelen) muizen. Opmerking de diepgaande vernietiging van epitheliale het platform en inflammatoire infiltreert (pijlpunten). Staafdiagram: letsel score. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Intestinale monocyt en macrofaag infiltreren.
DSS colitis was geïnduceerd in C57BL/6 door de toepassing van DSS (2% w/v) in het drinkwater. Controle muizen ontvangen drinkwater alleen. De gegevens van n = 5 muizen per groep staan ± SEM. (A) immunefluorescentie visualisatie van macrofaag infiltraties in de mucosa. Weergegeven zijn representatieve beelden van anti-F4/80 vlekken in colitic en de controle van de muizen. Staafdiagram: cel graaf/hoge kracht veld (HPF). (B) immunefluorescentie visualisatie van neutrofiele infiltraties van de mucosa. Weergegeven zijn representatieve beelden van anti-Gr-1 kleuring in colitic dieren en controles. Staafdiagram: graaf/HPF cel. (C) de concentratie van de MPO in het Colon weefsel van colitic en niet-colitic muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Monocyt aanwerving tot de intestinale compartiment.
Perifeer bloed monocyten van colitic muizen, alsmede controle muizen (n = 5 per groep) werden geanalyseerd door stroom cytometry voor de expressie van Ly - 6C op CD11b-positieve cellen. Cellen zijn gesorteerd op basis van de WS en de CD11b expressie. Muis monocyten werden geïdentificeerd als SSClageCD11bhoge cellen, en de uitdrukking van hun Ly6C was geanalyseerd. (A) proportioneel verandert naar inflammatoire Ly6Choge monocyten ten opzichte van pre experiment voorwaarden (% wijzigen ± SEM) worden afgebeeld. (B) FACS dot percelen Ly6C uitdrukking SSClowCD11bhoge cellen van colitic dieren vóór en na de colitis inductie (lagere panelen) en besturingselementen pre-en post experiment (bovenste panelen). (C) Splenocytes van colitic en niet-colitic muizen werden beoordeeld door stroom cytometry (gemiddelde fluorescentie intensiteit ± SEM) voor de expressie van F4/80. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Tomografische visualisatie van macrofaag infiltreren in lymfkliertest colitis.
FMT scant in colitic muizen en niet colitic besturingselementen beheerd Cyanine7-geconjugeerde antilichaam tegen lymfkliertest F4/80 (n = 5 per groep). (A) staafdiagram: totale fluorescentie intensiteit in pmol van kleurstof in de ROI is vastgesteld en afgebeelde ± SEM. vertegenwoordiger beelden worden weergegeven met de intensiteit van de fluorescentie van de gekleurde overeenkomt met de mate van inflammatoire infiltreren in muizen geïnjecteerd met de specifieke sonde (anti-muis F4/80) (B) en een aspecifieke besturingselement (rat IgG) (C). In beide gevallen stond een ROI van gelijke grootte dwars in de bovenbuik voor verdere analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Ex vivo validatie van tracer specificiteit in lymfkliertest colitis.
In vivo FMT scans in colitic muizen ingespoten met de specifieke sonde (anti-muis F4/80) werden gevolgd door ex vivo vlakke fluorescentie scans van transplanteren darmen om aan te tonen van de Colon oorsprong van het signaal van de tracer verkregen in vivo. Gegevens uit twee experimenten met een totaal van n = 8 dieren worden weergegeven. Representatieve beelden staan afgebeeld in vivo FMT scans van colitic muizen met gekleurde fluorescentie intensiteit die overeenkomt met de mate van inflammatoire infiltreren (A).Fluorescentie reflectiecoëfficiënt beeldvorming van het transplanteren darm maakt de identificatie van specifieke regio's met tracer accumulatie (B). Representatieve post-mortem immunefluorescentie kleuring voor F4/80-positieve macrofagen uit op deze oppervlakten bevestigt de resultaten van in vivo (C). Het aantal infiltreert in macrofagen, zoals bepaald door immunofluorescentie kleuring, werden gecorreleerd met in vivo gemeten tracer accumulatie (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel medische beeldvormingstechnieken zijn snel geëvolueerd in de afgelopen jaren, zijn we nog steeds beperkt in onze capaciteit om te ontdekken van inflammatoire processen of tumoren, evenals andere ziekten, in hun vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is echter cruciaal begrip tumorgroei, invasie, of metastasen ontwikkeling en cellulaire processen in de ontwikkeling van inflammatoire aandoeningen en immunologische, degeneratieve en cardiovasculaire ziekten. Terwijl de traditionele beeldvormingstechnieken is afhankelijk van lichamelijke of fysiologische parameters, kan moleculaire beeldvorming de visualisatie van specifieke moleculaire markers in vivo20.
Voor kleine dieren imaging, kunnen radionuclide gebaseerde benaderingen (bijvoorbeeld single-photon emission berekende tomografie (SPECT) en positron emissie tomografie (PET)), echografie en fluorescentie-gemedieerde beeldvorming worden gebruikt om te visualiseren specifieke structuren van het moleculaire doel. Langdurige labels, als lange omloop tijden en zacht weefsel penetratie vertraging de tijd voor imaging na tracer toepassing vereist het gebruik van full-length antilichamen als de meeste beschikbare tracer ruggengraat. Typische imaging radionucliden zijn daarom niet geschikt voor de beeldvorming in vivo van antilichaam distributie. Het gebruik van lange-levende isotopen zoals Cu64 of In111 kunt verklikstoffen antilichamen gebaseerde maar vraagt om een complexe infrastructuur isotoop generatie, veiligheid van de straling vóór en tijdens de labeling procedure, spanning en afgeschermd van de huisvesting van de dieren na toepassing van de sonde. De kosteneffectieve en veiliger variant zou worden fluorescentie-gemedieerde imaging.
Verschillende in vivo imaging systemen voor de detectie, hebben visualisatie en meting van fluorescente kleurstof distributie in levende dieren ingediend over de afgelopen twee decennia21. De meeste systemen kunnen snelle vlakke imaging geschikt voor oppervlakkige laesie imaging. Als gevolg van de absorptie van licht en verstrooiing, signalen diep in het weefsel onttrekken vlakke imaging. De meest prominente oplossing voor dit probleem is fluorescentie tomografie22. Gebaseerd op wiskundige modellering, het beeld signaal wordt gecorrigeerd voor verstrooiing en lichte absorptie en een virtuele 3D dataset wordt berekend uit de multi projectie dataset8. Het algoritme levert volledig kwantitatieve gegevens, waardoor de schatting van de concentratie van de tracer in specifieke regio's vertegenwoordiger van de doelgroep concentratie/expressie23. Een relevante beperking van FMT is gerelateerd aan slechte ruimtelijke resolutie ten opzichte van anatomische beeldvormingstechnieken, welke kan-afhankelijk van de gewenste doelgroep-compromis de toewijzing van moleculaire informatie aan specifieke anatomische structuren. Een andere beperking ligt in de beperkte indringingsdiepte van licht in weefsel, waarvoor het gebruik van sondes absorberen en oplichtende in het rood tot en met NIR spectraal bereik23.
Een onlangs geïntroduceerde imaging modaliteit die combineert de voordelen van morfologische echografie en de mogelijkheid van het verkrijgen van moleculaire informatie van fluorescentie beeldvorming is optoacoustic imaging. Voorlopige resultaten van vroege studies suggereren dat-ondanks een behoefte aan verdere technische verfijning-optoacoustic imaging houdt grote belofte voor moleculaire beeldvorming en potentiële translationeel toepassingen24.
De aanwerving van leukocyten aan de darmwand is een cruciale stap in de inleiding en de bestendiging van IBD, zoals de rekrutering van ontstekingscellen op de site van infectie of ontsteking in vele immuun-gemedieerde ziekte, zoals auto-immune ziekte, infectie, vaatziekten, tumorigenesis en veel meer25. Monocyt activering en infiltratie in de intestinale mucosa is een essentiële stap in de pathogenese van IBD, is remming van monocyt infiltratie, georkestreerd door chemokines en integrine-cellulaire adhesie molecuul interactie, een veelbelovende therapeutische 12,26te benaderen. Controle van leukocyten handel op de site van ontsteking is daarom cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties te visualiseren van de anti-inflammatoire effecten van de bestudeerde geneesmiddelen. Dit kan van bijzonder belang zijn, omdat de agenten gericht op leukocyten mensenhandel zijn ontwikkeld, en sommige anti-integrine antilichamen zijn al beschikbaar voor IBD therapie, terwijl verdere componenten beschikbaar zijn in de nabije toekomst26 zullen. Vedolizumab, een Latijnse monoclonal antilichaam tegen de darm-specifieke α4β7 integrine subeenheid, en Etrolizumab, die de β7-subunit van de intestinale α4β7 en αEβ7 integrine heterodimers bindt, heb goedgekeurde27,28. Andere agentia (bijvoorbeeld de MAdCAM-1 PF-00547659 en sphingosine-1-fosfaat (S1P) receptor modulatoren zoals Ozanimod) zijn momenteel de evaluatie voor de behandeling van IBD29,30.
Bij het uitvoeren van FMT, zijn eventuele wijzigingen van de techniek de selectie van verschillende tracer-target combinaties, evenals FMT combineren met structurele benaderingen te compenseren voor slechte ruimtelijke resolutie imaging. Een breed scala aan combinaties van de sonde-target heeft opgesteld en gecommercialiseerd. Voor specifieke projecten, de etikettering van aangepaste antilichamen kunnen worden gedaan met behulp van commerciële labeling kits en het hierboven beschreven protocol. Afhankelijk van het antilichaam of kleinere peptide gekozen als de targeting groep, bieden commerciële leveranciers een breed scala aan verschillende labels. Overwegen de gewenste kleurstof, afhankelijk van de toepassing: voor diep-weefsel imaging, een kleurstof die actief zijn in het NIR-spectrum (bijvoorbeeld Cy7, λex / em 750/780 nm) misschien wel geschikt, terwijl de algehele helderheid en effectieve licht levering van kleurstoffen actief in het in de buurt van de zichtbare bereik van het spectrum (bijvoorbeeld GFP analogen) misschien wenselijk zijn. Vrijwel alle kleurstoffen kunnen worden verkregen als een actieve ester label de lysine-residuen van proteïnen, alsook met alternatieve bindend wordt, zoals maleimides voor het binden van cysteïne of Biotine voor de etikettering van eiwitten uitgerust met specifieke labeling tags31 . De selectie van het label verandert niets aan het principe-protocol maar slechts kleine aanpassingen van de labeling procedure vereist en is belangrijk voor een goede beeldvorming resultaat. Een andere aantrekkelijke wijziging te overwinnen van de beperkingen in ruimtelijke resolutie is het combineren van FMT met CT of MRI, zodat de aantekening van anatomische structuren met moleculaire informatie.De structurele informatie kan ofwel worden verworven sequentieel als een priori informatie of gelijktijdig, waarvoor hybride imaging instrumentatie32,33.
Bepaalde stappen van het protocol verdienen bijzondere aandacht. Zoals deze techniek aangepast voor een veelheid van fluorescerende photoprobes die gericht zijn op een aantal specifieke moleculen representatief zijn voor verschillende moleculaire processen worden kan, is het essentieel om de voldoende spreiding van de sondes en verrijking in de regio van de gewenste doelgroep. Het ideale tijdstip voor beeldvorming kan variëren volgens de sonde-target combinatie. Bijvoorbeeld kan antilichaam doelgerichtheid van tumor-receptoren worden beïnvloed door de diffusie-rate tot tumoren, opname en metabolisme door de lever, en de mogelijke bijwerkingen van immunogene34. Ook overwegen relevante controlegroepen voor specifieke beeldvorming benaderingen. Specifieke traceurs moeten altijd worden gevalideerd tegen isotype besturingselementen als gevolg van de effecten van de perfusie en aspecifieke bindende (bijvoorbeeld Fc receptor-gemedieerde bindende). Doel-negatieve dieren kunnen dienen als een extra controle voor tracer specificiteit, als dergelijke knock-out modellen bestaat. Als alternatief, kan blokkeren experimenten worden uitgevoerd om te bewijzen dat de specificiteit van antilichaam-target interacties35.
De volgende zijn kritische stappen over de praktische aspecten van de procedure: (1) de gebruikte concentraties van DSS zorgvuldig te bepalen, zoals DSS gevoeligheid kan variëren tussen verschillende muis stammen en fabrikanten/batches36. (2) zorgvuldig sonde-target combinaties selecteren. (3) laat ongeveer 5 min van scannen tijd voor een voldoende scan van de hele buik. De optimale tijd wijs tussen tracer toepassing en de beeldvorming procedure moet zorgvuldig worden bepaald dat voor tracer accumulatie in de regio van de gewenste doelgroep. Voor de intestinale F4/80 detectie in lymfkliertest colitis, moet de gelabeld antilichaam 24 h vóór het scannen worden geïnjecteerd. (4) als aspecifieke label accumulatie kan optreden (bijvoorbeeld in de lever), is het van cruciaal belang om het juiste doelweefsel label als ROI door het plaatsen van de respectieve meetgereedschappen. Bovendien worden voldoende controles voor aspecifieke tracer distributie opgenomen-overwegen aspecifieke isotype besturingselementen uit perfusie effecten en knock-out of blokkerende studies om te valideren tracer-doel interactie te sluiten.
Typische bronnen van fout met betrekking tot de scanning procedure en gegevens wederopbouw onjuist dierlijke positie, scannen veld en de blootstellingstijd. Wanneer positionering van het dier, moet de fluorescerende laesie worden omringd door weefsel aan alle kanten om te minimaliseren van wederopbouw lawaai. Luchtbellen gevangen tussen het dier en de voorste glasplaat van de beeldvorming cassette kunnen ook ruis toenemen en moeten worden verwijderd door het dier iets te verplaatsen. Over- of onderbelichting van de afbeelding kunt vereisen een reacquisition scan met gemodificeerde belichtingsinstellingen, die kan worden gevonden in het scherm scannen (reflectie afbeelding blok: aanpassingen van de LED aan de voorkant intensiteit en blootstelling tijd). Bij het combineren van in vivo antilichaam gebaseerde FMT metingen met post-mortem histologische analyses, zoals immunohistochemistry of immunefluorescentie kleuring, moet het gebruik van antilichamen van dezelfde kloon en opmaak worden beschouwd. Ook bij het uitvoeren van repetitieve FMT metingen in dezelfde dieren, moeten de dezelfde opmaak en klonen worden gebruikt ter voorkoming van mogelijke Kruisallergie of de doelgerichtheid van verschillende epitopen.
Tezamen, maakt fluorescentie gemedieerde-moleculaire tomografie het repetitieve toezicht op het verloop van de ziekte en onderliggende pathofysiologische processen. Het kan worden toegepast op een overvloed van biomedische studies en wellicht nuttig om te versnellen drug testen of als een objectieve eindpunt in geïndividualiseerd therapieën. FMT-targeting van macrofagen F4/80-uitdrukken in modellen van ontsteking biedt een waardevolle noninvasive instrument om te visualiseren en kwantificeren van de infiltratie en de accumulatie van ontstekingscellen terwijl blijkt ook goede correlatie met conventionele uitlezingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber en Mrs. Klaudia Niepagenkämper voor de uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al.
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
