JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

زرع شوان الخلايا داخل قنوات PVDF-ترف سد الفئران بحف الحبل الشوكي جذوعها لتعزيز التجديد إكسون عبر الفجوة

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

توضح هذه المقالة تقنية لإدراج قناة جوفاء بين جذوعها الحبل الشوكي بعد ترانسيكتيون كاملة والتعبئة مع خلايا شوان (SCs) ومصفوفة الغشاء القابلة للحقن من أجل سد وتشجيع التجديد إكسون عبر الفجوة.

Abstract

بين النماذج المختلفة لإصابات النخاع الشوكي في الفئران، ومعظم الأحيان يستخدم نموذج كدمة لأنه هو النوع الأكثر شيوعاً لإصابة الحبل الشوكي البشرية. نموذج ترانسيكشن كاملة، على الرغم من أن الصلة لا سريرياً كنموذج كدمة، هو الأسلوب الأكثر صرامة لتقييم التجدد إكسون. في نموذج كدمة، من الصعب تمييز المجددة من محاور عصبية ظهرت أو إخباري بسبب وجود المتبقية الأنسجة بعد الإصابة. في طراز ترانسيكشن كاملة، أسلوب الجسور اللازمة سد هذه الفجوة وإنشاء الاستمرارية من روسترال إلى جذوعها والذيلية لتقييم مدى فعالية العلاجات. عملية جراحية يمكن الاعتماد عليها في سد ضروري لاختبار مقاييس النتائج عن طريق الحد من التفاوت بسبب الطريقة الجراحية. وتستخدم البروتوكولات المذكورة هنا لإعداد شوان الخلايا (SCs) وقنوات قبل الزرع، ترانسيكشن كاملة في النخاع الشوكي على مستوى الصدر 8 (T8)، إدراج القناة، وزرع المنبوذة في القناة. ويستخدم هذا النهج أيضا في الموقع التبلور لمصفوفة الغشاء عن طريق الحقن مع زرع اتفاقية استكهولم أن يسمح النمو إكسون محسنة عبر واجهات روسترال ووالذيليه مع أنسجة المضيف.

Introduction

إصلاح إصابات النخاع الشوكي هو مشكلة معقدة وصعبة تتطلب استراتيجية علاج التوافقي تشمل، على سبيل المثال، استخدام الخلايا ومادة بيولوجية لتوفير المكروية مواتية لوظيفة الخلايا المزروعة ومحور عصبي التجديد في الموقع الإصابة. هيميسيكشن1،2،3،4،5،،من67،،من89 وكامل ترانسيكشن10 ،11،،من1213،14،15،16،،من1718،19 20، ،،من2122 نماذج تستخدم بشكل متكرر لتقييم آثار العلاجات الجسور على أساس مادة بيولوجية. الاستفادة من استخدام نموذج هيميسيكشن أنه يوفر المزيد من الاستقرار لبناء الجسور بالمقارنة مع ترانسيكشن كاملة. ومع ذلك، في نماذج هيميسيكشن، وأنه يصعب إثبات التجدد إكسون كنتيجة للأسلوب العلاجي التطبيقية بسبب الوجود أنسجة إخباري. الطراز ترانسيكتيون كاملة هو الأسلوب الأكثر صرامة لإثبات إكسون التجدد.

تمت دراسة مختلف المواد الطبيعية والاصطناعية للاستخدام كجل القابلة لحقن، وهلام شكلت قبل وضعها في كدمة أو نماذج هيميسيكتيون، أو كقناة منظم في هيميسيكتيون أو إكمال نماذج ترانسيكتيون (مفصلة في ملاحظات23 , 24 , 25)-التبلور في عين المكان لأن خليط الحقن مصفوفة/SC ينشئ واجهة أكثر تساهﻻ بين الزرع والحبل المضيف لعبور إكسون26،27 مقارنة بزراعة ما قبل تبلور مصفوفة/SC 5 , 18 , 19 , 28– في الموقع التبلور يسمح المصفوفة كفاف حول الواجهات المضيف غير النظامية بينما قناة أكثر جمودا ومنظم أو هلام شكلت قبل أقل تعمل لا يمكن. غالباً ما توفر قناة منظم الاستقرار التوجيه وزرع الاتصال على عكس مصفوفة عن طريق حقن. البروتوكولات المقدمة هنا وصف إجراء العمليات جراحية التي يستفيد من مصفوفة غشاء عن طريق حقن (مثلاً، ماتريجيل، انظر الجدول للمواد المشار إليها كمصفوفة الحقن هنا) وقناة منظم إلى تقييم التجدد إكسون في نموذج إصابة الحبل الشوكي الأكثر صرامة.

اليكتروسبون بولي-فينيليدينيديفلوريدي-تريفلوروثيليني (PVDF-ترف) تستخدم قنوات أجوف الليفي المنحازة في نهجنا التجريبية. PVDF-ترف هو بوليمر كهرضغطية يولد شحنة عابرة عندما ميكانيكيا مشوه وقد ثبت أن تعزيز تجديد التمديد ومحور عصبي نورت في المختبر29،30 و في فيفو 31-اليكتروسبينينج هو أسلوب تصنيع سقالة مشتركة التي يمكن أن تنتج سرعة السقالات الليفي موثوق بها باستخدام مجموعة متنوعة من البوليمرات مع خصائص يمكن السيطرة عليها مثل محاذاة الألياف والألياف القطر، وسمك السقالة ل العصبية وغيرها من التطبيقات32،،من3334.

وقد أثبتت دراسات عديدة من الفئران المنبوذة التي زرعها في مواقع إصابات النخاع الشوكي العلاج فعالية5،9،،من1819،20،21 ،26. يتم زرع هذه محصن للأنسجة المحيطة بالآفة وتقليل حجم تجويف الآفة وتعزيز التجدد إكسون في موقع الآفة/زرع وميليناتيون من محاور عصبية المجددة. يمكن زرعها المنبوذة البشرية أوتولوجوسلي، وميزة مقارنة بمعظم الأخرى العصبية المتصلة الخلايا24. بعد خزعة الأعصاب المحيطية، يمكن عزل الطوائف المنبوذة وتنقيته وسوف تنتشر على المبلغ المطلوب لزرعها في البشر. زرع SC ذاتي لمرضى إصابة الحبل الشوكي وقد ثبت أن تكون آمنة في إيران35،36،،من3738،39،الصين40، 41،الولايات المتحدة42. تعرف الطوائف المنبوذة لإفراز العديد من عوامل نيوروتروفيك والمصفوفة خارج الخلية البروتينات الهامة لنمو إكسون وتلعب دوراً أساسيا في تجديد إكسون بعد إصابة الأعصاب المحيطية. أن هدفنا هنا هو لوصف الأساليب التي يمكن التحقيق في التصاميم ممرا لتحسين نتائج زرع اتفاقية استكهولم في نموذج ترانسيكشن حبل الشوكي الفئران كاملة.

Protocol

يتم إيواء الإناث الكبار فيشر الفئران (180-200 غ وزن الجسم) وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة ووزارة الزراعة. “العناية بالحيوان” واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميامي المؤسسية وافق جميع الإجراءات الحيوان. 1-“إعداد” ما قبل الزرع إعداد قناة. قطع ممر…

Representative Results

والهدف من استخدام هذا الأسلوب الجراحي هو لتقييم استخدام قناة تنظيماً ومصفوفة الحقن التي يعظم دالة اتفاقية استكهولم بعد زرع في الحبال الشوكي بحف المكتملة. ثلاثة أسابيع بعد زرع الأعضاء، هي perfused الحيوانات مع بارافورمالدهيد 4% والأعمدة الشوكي صارخ تشريح وإصلاحها في مثبت نف?…

Discussion

أن الخطوة الأكثر أهمية في خلق نموذج ترانسيكشن فعال هو قطع الحبل الشوكي في التخفيضات واحد أو اثنين. 2-2.5 ملم فجوة بين جذوعها الحبل الشوكي روسترال ووالذيليه أن يكون حاضرا في الموقع ترانسيكشن. ثلاثة أسباب هذه فجوة لا تظهر الأكثر احتمالاً هي الجذور الظهرية/البطني (1) لم يتم إزالتها بشكل صحيح، ول?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر النواقل الفيروسية والحيوان النوى في “مشروع ميامي” “علاج شلل” المنتجة لينتي-التجارة والنقل-الفيروس وتوفير الرعاية الحيوانية، على التوالي، وعلم الأنسجة و “أساسيات التصوير” لاستخدام كريوستات، مجهر [كنفوكل]، و مجهر فلوري مع “محقق ستيريو”. تم توفير التمويل بوزارة الدفاع (W81XWH-14-1-0482)، نيندس (09923) وجبهة الخلاص الوطني (هيئة الهجرة واللاجئين-1006510). بانج M.B. هو “كريستين ه لين الموقر أستاذ لعلم الأعصاب”.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure
check_url/fr/56077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image