JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Трансплантация Шванновские клетки внутри трубы PVDF-ТрФЭ для преодоления пересекал крыса спинного пни способствовать регенерации аксона через разрыв

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Эта статья описывает метод для вставки полые связующим звеном между спинного пни после полного перерезка и заполнить Шванновские клетки (СКС) и инъекционные базальной мембраны матрицы для моста и способствуют регенерации аксона через пробел.

Abstract

Среди различных моделей для спинного мозга крыс наиболее часто используется модель ушиба, потому что это наиболее распространенный тип спинного мозга человека. Полный перерезка модель, хотя не как клинически значимых как модель ушиба, является наиболее строгий метод оценки регенерации аксона. В модели ушиба трудно отличить регенерированного из проросших или пощадил аксоны благодаря наличию остающихся пост повреждения тканей. В модели полного перерезка метод перемычки необходимо заполнить этот пробел и создать преемственность с ростральной хвостового пни для того чтобы оценить эффективность лечения. Надежный мост хирургия имеет важное значение для проверки исходов снижая изменчивость из-за хирургический метод. Протоколы, описанные здесь используются для подготовки Шванновские клетки (СКС) и трубопроводы до трансплантации, полный перерезка спинного мозга на грудном уровне 8 (T8), вставить каналом и пересадить СКС в канал. Этот подход также использует в situ гелеобразующего инъекционные базальной мембраны матрицы с SC трансплантации, который позволяет улучшенная аксона роста через интерфейсы ростральной и хвостового с ткани макроорганизма.

Introduction

Ремонт повреждений спинного мозга является сложной и трудной проблемой, которая потребует стратегии комбинаторного лечения с участием, например, использование клеток и биоматериал обеспечить благоприятное микроокружение для функции пересаженных клеток и аксон Регенерация на месте травмы. Гемисекция1,2,3,4,5,6,,78,9 и полный перерезка10 ,11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,20,,2122 модели часто используются для оценки последствий на основе биоматериала преодоление терапии. Преимущество использования гемисекция модель является, что он обеспечивает большую стабильность для моста конструкции, по сравнению с полной перерезка. Однако в моделях гемисекция, трудно доказать регенерации аксона как результат прикладной терапевтического метода связано с наличием пощадил ткани. Полный перерезка модель является наиболее строгий метод продемонстрировать регенерации аксона.

Были изучены различные природные и синтетические материалы для использования в качестве инъекционный гель, предварительно сформированных гель помещается в ушиб или гемисекция модели, или как структурированной каналом в гемисекция или завершить перерезка модели (подробные отзывы23 , 24 , 25). в situ гелеобразующего смеси инъекционные матрица/SC создает более либеральными интерфейс между трансплантации и принимающей шнур для axon пересечения26,27 по сравнению с предварительно загущенное матрица/SC имплантатов 5 , 18 , 19 , 28. в situ гелеобразующего допускается матрицы контур вокруг нерегулярных хост интерфейсов, в то время как более жесткой и структурированных каналом или менее moldable предварительно сформированных гель не может. Структурированный каналом часто обеспечивает контакт руководство и имплантат стабильность в отличие от инъекционного матрицы. Протоколы, здесь представлены описания хирургическая процедура, которая использует матрицу инъекционные базальной мембраны (например, matrigel, см. Таблицу материалы, упоминаемые как инъекционные матрицы здесь) и структурированных каналом для Оцените регенерации аксона в самые строгие модели травмы спинного мозга.

Electrospun поли vinylidenedifluoride трифторэтиленом (PVDF-ТрФЭ) соответствие волокнистых полые трубы используются в нашем экспериментальном подходе. PVDF-ТрФЭ является пьезоэлектрический полимер, который генерирует переходных заряда, когда механически деформируется и показал neurite расширение и аксон регенерации в vitro29,30 и в естественных условиях 31. Electrospinning является распространенным методом изготовления лески, который может быстро производить надежные волокнистых подмостей, с использованием различных полимеров с управляемыми свойствами, такими как выравнивание волокна, волокна диаметр и толщину лески для Нейронные и других приложений32,,3334.

Многочисленные исследования крыс SCs, пересаженные в сайты травмы спинного продемонстрировали лечения эффективность5,9,18,19,20,21 ,26. Эти трансплантаты являются нейропротекторной для ткани вокруг очага поражения, уменьшить размер полости поражения и способствуют регенерации аксона в сайт поражения/трансплантации и миелинизации регенерированный аксонов. Можно autologously трансплантированы человеческой SCs, преимущество по сравнению с большинством других связанных с нервной клетки24. После биопсии периферических нервов, СКС может быть изолированный и очищенный и будет распространяться на нужную сумму для трансплантации в людей. Аутологичной трансплантации SC для позвоночника пациентов было доказано быть безопасными в Иране35,,3637,38, Китай39,40и 42Соединенные Штаты41,. СКС, как известно, выделяют многочисленные нейротрофических факторов и белков внеклеточного матрикса, важное значение для роста аксона и играть важную роль в регенерации аксона после травмы периферических нервов. Наша цель здесь — для описания методов, которые можно исследовать трубы конструкции улучшить результаты трансплантации SC в полной крыса спинного перерезка модели.

Protocol

самок взрослых Фишер (180-200 г веса тела) размещаются согласно низ и USDA руководящие принципы. Институциональные животное уход и использование Комитет (IACUC) из университета Майами одобрил все животные процедуры. 1. подготовка предварительного трансплантации канал…

Representative Results

Цель использования этой хирургической техники заключается в оценке использования структурированных каналом и инъекционные матрица, которая максимизирует SC функция после пересадки в завершенных пересекал шнуры спинного мозга. Через три недели после пересадки, живо?…

Discussion

Наиболее важным этапом в создании эффективной перерезка модели разрыва спинного мозга в одной или двух разрезов. 2-2,5 мм зазор между ростральной и хвостовой спинного пни должны присутствовать на сайте перерезка. Три наиболее вероятные причины такой разрыв не появляется являются (1) спин…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить вирусный вектор и животных ядер в Майами проекта для лечения паралича для производства lenti-GFP-вирус и обеспечение ухода за животными, соответственно, гистология и изображений ядра для использования криостат, конфокального микроскопа, и Флуоресцентный микроскоп с стерео следователь. Финансирование было предоставлено NSF (DMR-1006510), NINDS (09923) и МО (W81XWH-14-1-0482). М.б. Бунге является Кристина E Линн Уважаемый профессор неврологии.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure
check_url/fr/56077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image