PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포
Summary
이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.
Abstract
쥐에서 척수 부상에 대 한 다양 한 모델 중에서 박상 모델 그것은 인간의 척수 상해의 가장 일반적인 유형 때문에 가장 자주 사용 됩니다. 전체 transection 모델 비록 타 박상 모델로 하지으로 임상으로 관련 축 삭 재생을 평가 하기 위해 가장 엄격한 방법입니다. 타 박상 모델에서 조직 게시물 부상을 나머지의 존재로 인해 부 화 또는 절약 axons에서 재생성 구별 하기가 어렵습니다. 완전 한 transection 모델에는 브리징 방법은 격차를 만들어 연속성 있는 rostral에서 꼬리 젊고 아름 다운 여자를 치료의 효과 평가 하는 데 필요한입니다. 신뢰할 수 있는 브리징 수술 수술 방법에 따른 가변성을 감소 결과 측정을 테스트 하는 필수적 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 Schwann 세포 (SCs)를 준비 하는 데 사용 됩니다 이식, 흉부 레벨 8 (T8)에서 척수의 완전 한 transection 전 도관에 도관을 삽입 하 고 도관으로 SCs를 이식. 이 접근은 또한 제자리에 고 SC 이식 호스트 조직으로 rostral와 꼬리 인터페이스를 통해 향상 된 축 삭 성장을 허용 하는 주 사용 지하실 멤브레인 행렬의 사용 합니다.
Introduction
척수 부상 수리는 관련 된, 예를 들어 조합 처리 전략을 필요로 하는 복잡 하 고 어려운 문제, 세포와 이식된 세포 기능 및 축 삭에 대 한 유리한 microenvironment를 제공 하는 소재를 사용 하 여 다시 부상의 생성 사이트 Hemisection1,2,,34,5,6,7,,89 및 완료 transection10 ,11,12,13,14,15,,1617,18,19 ,20,,2122 모델 소재 기반 브리지 치료의 효과 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. Hemisection 모델을 사용 하 여의 장점은 그것 완료 transection에 비해 브리징 구문에 대 한 더 많은 안정성을 제공입니다. 그러나, hemisection 모델, 그것은 절약된 조직의 존재로 인해 적용 된 치료 방법의 결과로 축 삭 재생을 증명 어렵다. 완전 한 transection 모델은 축 삭 재생을 보여 주기 위해 가장 엄격한 방법입니다.
다양 한 자연 및 합성 물질 주사 젤으로 사용 하기 위해 연구, 미리 형성 된 젤 hemisection에 타 박상 또는 hemisection 모델 또는 구조적된 도관 배치 또는 transection 모델 (에 대 한 자세한 리뷰23 를 완료합니다 , 24 , 25). 제자리에서 고 주 사용 매트릭스/SC 혼합물의 이식 및 축 삭 교차점26,27 미리 gelled 매트릭스/SC 임 플 란 트에 비해 호스트 코드 사이 더 인터페이스를 만듭니다 5 , 18 , 19 , 28. 제자리에서 고 허용 더 엄밀 하 고 구조화 된 도관 또는 덜 moldable 미리 형성 된 젤 수 없습니다 반면 불규칙 한 호스트 인터페이스 주위 윤곽을 매트릭스. 구조화 된 도관 자주 주사 매트릭스 달리 연락처 지침과 임 플 란 트 안정성을 제공합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 (예: matrigel, 주사 매트릭스 여기로 테이블의 자료를 참조 하는 참조) 및 구조화 된 도관을 이용 하는 수술 가장 엄격한 척수 손상 모델에서 축 삭 재생을 평가 합니다.
Electrospun 폴 리-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF TrFE) 정렬 된 섬유 빈 도관 우리의 실험적인 접근 방식에 사용 됩니다. PVDF TrFE는 기계적으로 변형 하는 경우 임시 충전을 생성 하 neurite 연장 및 축 삭 재생을 촉진을 보여줘 왔다 압 전 폴리머29,30 생체 외에서그리고 vivo에서 31. 전기는 빠르게 제어 속성 섬유 정렬, 섬유 직경, 및을 위한 발판의 두께 등 다양 한 고분자를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 섬유 건설 기계를 생산할 수 있는 일반적인 비 계 제조 방법 신경 및 기타 응용 프로그램32,,3334
쥐 척수 부상 사이트에 이식 하는 SCs의 수많은 학문은 치료 효능5,9,,1819,20,21 설명 했다 ,26. 이러한 이식 병 변 주위의 조직에 대 한 신경, 병 변 캐비티 크기를 줄일 수 있으며 병 변/이식 사이트 및 myelination 재생성 된 축 삭의 축 삭 재생을 촉진. 인간의 SCs autologously 이식 될 수 있습니다, 그리고 이점을 비교 될 때 대부분의 다른 관련 된 신경 세포24. 말 초 신경 생 검 후 SCs 수 고립 된 고 정화 및 인간으로 이식에 대 한 원하는 금액을 확산 것입니다. 척수 부상 환자에 대 한 헌 SC 이식 이란35,36,,3738, 중국39,40, 안전한 것으로 입증 되었습니다 및 미국41,42. SCs는 수많은 neurotrophic 요인 및 축 삭 성장을 위한 중요 한 세포 외 기질 단백질을 분 비 하 고 말 초 신경 손상 후 축 삭 재생에 필수적인 역할을 알려져 있습니다. 우리의 목표는 여기 도관 디자인 완전 한 쥐 척수 transection 모델에 SC 이식의 결과 개선 하기 위해 조사할 수 있는 방법을 설명 하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효과적인 transection 모델을 만드는 가장 중요 한 단계는 하나 또는 두 개의 상처에서 척수 절단은. Rostral와 꼬리 척수 젊고 아름 다운 여자 사이 2-2.5 m m 간격 transection 사이트에 존재 해야 합니다. 나타나지 않는 이러한 격차에 대 한 세 가지 가능성이 가장 높은 이유는 (1) 등/복 부 뿌리 제대로 제거 되지 않은, (2) 복 부 두 라 적절 하 게, 제거 되지 않았습니다 및 (3) 동물 그녀 아래 배치 롤에 제대로 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 드리고 싶습니다 바이러스 성 벡터와 동물 코어 치료 마비에 마이애미 프로젝트에서 각각 lenti GFP 바이러스 및 제공 동물 관리, 생산 및 조직학 및 이미징 코어 cryostat, confocal 현미경의 사용에 대 한 고 스테레오 탐정 형광 현미경입니다. 자금 NINDS (09923), 국방부 (W81XWH-14-1-0482), NSF (DMR-1006510)에 의해 제공 했다. M.B. Bunge는 크리스틴 E 린 저명한 교수의 신경 과학 이다.
Materials
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
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