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Médecine

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.

Abstract

Parmi les différents modèles pour la blessure de la moelle épinière chez le rat, le modèle de la contusion est le plus souvent utilisé parce que c’est le type le plus commun de la moelle épinière humaine. Le modèle de transection complète, bien que pas aussi cliniquement pertinente que le modèle de la contusion, est la méthode la plus rigoureuse pour évaluer la régénération axonale. Dans le modèle de la contusion, il est difficile de distinguer régénérée des axones germés ou épargnés en raison de la présence d’autres lésions post. Dans le modèle de transection complète, une méthode de raccordement est nécessaire pour combler le vide et de créer une continuité de la rostrale des caudales souches afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Une chirurgie de pontage fiable est indispensable pour tester les mesures de résultats en réduisant la variabilité due à la méthode chirurgicale. Les protocoles décrits ici sont utilisées pour préparer Schwann, cellules (SCs) et conduits avant la greffe, une résection complète de la moelle épinière au niveau thoracique 8 (T8), insérer le tube et transplant SCs dans le conduit. Cette approche utilise également en situ gélifiant d’une matrice injectable membrane basale avec transplantation SC qui permet la croissance axonale améliorée via les interfaces rostrales et caudales avec les tissus de l’hôte.

Introduction

Réparation de lésions de la moelle épinière est un problème complex et difficile qui nécessitera une stratégie de traitement combinatoire impliquant, par exemple, l’utilisation de cellules et un biomatériau pour fournir un micro-environnement favorable pour la fonction des cellules transplantées et axon régénération sur le site de lésion. Hémisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 et transection complète10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modèles sont fréquemment utilisés pour évaluer les effets des thérapies ponts à base de biomatériaux. L’avantage d’utiliser un modèle hémisection est qu’il offre plus de stabilité pour la construction de pontage par rapport à la résection complète. Toutefois, dans les modèles hémisection, il est difficile de prouver la régénération axonale à l’issue de la méthode thérapeutique appliquée en raison de la présence de tissu épargné. Le modèle de transection complète est la méthode la plus rigoureuse de démontrer la régénération axonale.

Divers matériaux naturels et synthétiques ont été étudiés pour une utilisation comme un gel injectable, un gel pré-formé placé dans une contusion ou hémisection modèles, ou comme un conduit structuré dans hémisection ou toutes les modèles de transection (détaillés dans les commentaires23 , 24 , 25). in situ gélifiant d’un mélange de matrice/SC injectable crée une interface plus permissive entre la greffe et le cordon de l’hôte pour axon passage26,27 par rapport aux implants pré gélifié matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gélifiant a permis la matrice au contour autour des interfaces hôte irrégulière, alors qu’une conduite plus rigide et plus structurée ou un gel moins malléable préformé ne pouvait pas. Une conduite structurée offre souvent une stabilité orientation et implant contact contrairement à une matrice injectable. Les protocoles présentés ici décrivent une procédure chirurgicale qui profite des fois une matrice injectable membrane basale (p. ex., matrigel, voir la Table des matières, dénommé comme matrice injectable ici) et un tuyau structuré en vue de évaluer la régénération axonale dans le modèle de blessure de la moelle épinière plus rigoureux.

Électrofilées poly-vinylidenedifluoride-trifluoroéthylène (PVDF-TrFE) alignées fibreux conduites creux sont utilisés dans notre approche expérimentale. PVDF-TrFE est un polymère piézoélectrique qui génère une charge transitoire lorsque déformée mécaniquement et a été montré pour favoriser la régénération d’extension et axon neurites fois in vitro29,30 et in vivo 31. électrofilage est une méthode de fabrication échafaudage commune capable de produire rapidement des échafaudages fibreux fiables en utilisant une variété de polymères ayant des propriétés contrôlables telles que l’alignement de fibre, fibre de diamètre et l’épaisseur de l’échafaud pour neural et d’autres applications32,33,34.

De nombreuses études sur le rat SCs repiquées dans des sites de lésion de la moelle épinière ont démontré traitement efficacité5,9,18,19,20,21 ,26. Ces greffes sont neuroprotecteurs pour tissu qui entoure la lésion, de réduire la taille de cavité de lésion et promouvoir la régénération axonale dans le site de la lésion/transplantation et la myélinisation des axones régénérés. SCs humaines peuvent être transplantées autologously, un avantage par rapport à la plupart des autres neurones liés cellules24. Après une biopsie de nerf périphérique, SCs peuvent être isolées et purifiées et va proliférer à la quantité désirée pour la transplantation dans les humains. Autogreffe de SC pour les patients de la moelle épinière blessée a été prouvé pour être sûr en Iran35,36,37,38, Chine39,40et la United States41,42. SCs sont connus pour sécréter des nombreux facteurs neurotrophiques et les protéines de la matrice extracellulaire importants pour la croissance de l’axone et à jouer un rôle essentiel dans la régénération axonale après une lésion des nerfs périphériques. Notre objectif ici est de décrire les méthodes qui peuvent enquêter sur des conceptions de conduit pour améliorer les résultats de la transplantation de SC dans un modèle de transection de moelle épinière de rat complet.

Protocol

rats femelles adultes de Fischer (180-200 g de poids corporel) sont logés conformément aux directives NIH et USDA. L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et un animalier institutionnel approuvé toutes les procédures animaux. 1. préparation avant Transplantation préparation Conduit. Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection. NOTE : Le diamètre intérieur du conduit…

Representative Results

L’objectif de l’utilisation de cette technique chirurgicale consiste à évaluer l’utilisation d’un conduit structuré et matrice injectable qui maximise la fonction SC après la transplantation en rempli sectionnées moelles épinières. Trois semaines après la transplantation, les animaux sont perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et les colonnes vertébrales sont grossièrement disséqués et fixe le même fixateur pour encore 24 h. La moelle épinière est ensuite disséqu?…

Discussion

L’étape la plus importante dans la création d’un modèle efficace de transection est sectionnant la moelle épinière dans une ou deux coupes. Un écart de 2 à 2,5 mm entre les souches médullaires rostral et caudale devrait être présent sur le site de transection. Les trois raisons très probables de tel un fossé n’apparaissant ne pas sont (1) les racines dorsales/ventrale n’étaient pas correctement supprimés, (2) la dure-mère ventrale n’a pas été éliminée adéquatement et/ou (3) l’animal n’é…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le vecteur Viral et les noyaux de l’Animal au projet de Miami à la paralysie de la Cure pour produisant la lenti-GFP-virus et fournissant soins des animaux, respectivement et l’histologie et noyaux d’imagerie pour l’utilisation du cryostat, microscope confocal, et microscope à fluorescence avec stéréo enquêteur. Financement a été assuré par NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) et NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge est le Christine E Lynn distingué professeur de neurosciences.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
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References

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Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
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