JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Nakli Schwann hücreleri kopuk sıçan Spinal Kord kütükleri arasında boşluk Axon rejenerasyon teşvik için köprü için PVDF-TrFE borular içinde

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Bu makalenin tam transeksiyon sonra spinal kord kütükleri ve dolgu Schwann hücreleri (SCs) ve köprü ve akson rejenerasyon arasında boşluk teşvik için enjekte edilebilir membran matris ile arasında içi boş bir kanal eklemek için bir teknik anlatılmaktadır.

Abstract

İnsan Medulla Spinalis Yaralanmalarında en yaygın türü olduğundan Medulla Spinalis Yaralanmalarında Sıçanlarda için çeşitli modeller arasında en sık kontüzyonu modeli kullanılır. Tam transeksiyon modeli olarak klinik kontüzyonu model olarak axon rejenerasyon değerlendirmek için en titiz yöntemi olsa da. Kontüzyonu modelinde, çöllerde veya masraftan aksonlar doku sonrası yaralanma kalan varlığını nedeniyle gelen rejenere ayırt etmek zordur. Tam transeksiyon modelinde köprüleme yöntemi boşluğu doldurmak ve süreklilik rostral Kaudal kütükleri tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için oluşturmak gereklidir. Güvenilir bir köprüleme ameliyat sonuç ölçümleri değişkenlik nedeniyle cerrahi yöntem azaltarak test etmek esastır. Burada açıklanan protokoller Schwann hücreleri (SCs) hazırlamak için kullanılır ve borular nakli, omurilik torasik düzeyde 8 (T8), tam transeksiyon önce boru yerleştirin ve SCs boru nakli. Bu yaklaşım aynı zamanda ana bilgisayar doku rostral ve Kaudal arabirimleriyle arasında geliştirilmiş axon büyüme sağlar SC nakli ile enjekte edilebilir membran Matrix in situ gelling kullanır.

Introduction

Omurilik yaralanma onarım olduğunu içeren, örneğin bir birleşimsel tedavi stratejisi gerektiren karmaşık ve zorlu bir sorun, hücreleri ve Transplante hücre işlevi ve akson olumlu bir microenvironment sağlamak için biomaterial kullanımı yaralanma rejenerasyon sitesinde. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 ve tam transeksiyon10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelleri sık sık biomaterial tabanlı köprüleme terapiler etkilerini değerlendirmek için kullanılır. Hemisection manken kullanmanın avantajı için tam transeksiyon karşılaştırıldığında köprüleme inşa etmek için daha fazla istikrar sağlar olduğunu. Ancak, hemisection modellerinde, kararlara dokusunun varlığı nedeniyle uygulanan tedavi yöntemi bir sonucu olarak axon rejenerasyon kanıtlamak zordur. Tam transeksiyon modeli axon rejenerasyon göstermek için en titiz bir yöntemdir.

Çeşitli doğal ve sentetik malzeme enjekte edilebilir bir jel olarak kullanmak için inceledik, önceden biçimlendirilmiş jel kontüzyonu veya hemisection modelleri ya da yapısal bir iletken olarak hemisection yerleştirilen veya transeksiyon modelleri (ayrıntılı değerlendirmeleri23 ‘ tamamlamak , 24 , 25). in situ bir enjekte edilebilir matris/SC karışımı gelling nakli ve ana bilgisayar kablosu önceden genellikle matris/SC implantlar için karşılaştırıldığında axon geçiş26,27 arasında fazla izin veren bir arabirim oluşturur 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelling izin daha sert ve yapılandırılmış bir kanal ya da daha az bomba önceden biçimlendirilmiş jel olamazdı, ancak düzensiz konak arayüzlerinin kontur matris. Yapılandırılmış bir kanal kez enjekte edilebilir bir matris aksine iletişim rehberlik ve implant istikrar sağlar. Burada sunulan iletişim kurallarını (Örneğin, matrigel, enjekte edilebilir matris olarak Malzeme tablo başvurulan bakınız) bir enjekte edilebilir membran matris ve yapılandırılmış bir kanal için yararlanır bir cerrahi açıklayınız Axon rejenerasyon en titiz omurilik yaralanma modelinde değerlendir.

Electrospun Poli-vinylidenedifluoride-hizalanmış fibröz içi boş boru deneysel yaklaşımımız kullanılan trifluoroethylene (PVDF-TrFE). PVDF-TrFE olduğunu ne zaman mekanik olarak deforme geçici bir ücret oluşturur ve neurite uzantısı ve akson rejenerasyon teşvik için gösterilen bir piezoelektrik polimer vitro29,30 ve içinde vivo 31. Electrospinning olduğunu hızla fiber hizalama, lif çapı ve İskele için kalınlığı gibi kontrol edilebilir özellikleri polimerler çeşitli kullanarak güvenilir fibröz iskele üretebilir ortak bir iskele imalat yöntemi Sinirsel ve diğer uygulamalar32,33,34.

Çok sayıda çalışma sıçan spinal kord yaralanması siteleri nakledilen SCs tedavi etkinliği5,9,18,19,20,21 göstermiştir ,26. Bu nakli nöroprotektif lezyon çevreleyen doku için vardır, lezyon boşluğu boyutunu küçültmek ve rejenere aksonlar myelination ve lezyon/nakli site içine axon rejenerasyon teşvik. İnsan SCs autologously nakledilen, zaman için diğer birçok ilgili sinirsel göre bir avantaj24hücreleri. Periferik sinir biyopsi sonra SCs izole ve saf ve insanlar içine nakli için istediğiniz miktarı için çoğalırlar. Otolog SC nakli omurilik yaralı hastalar için Iran35,36,37,38, Çin39,40, güvenli olması için kanıtlanmış ve Amerika Birleşik Devletleri41,42. SCs bilinen çok sayıda Nörotrofik faktörler ve hücre dışı matriks proteinlerinin axon büyüme için önemli salgılar ve akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra periferik sinir yaralanma önemli bir rol oynamaktadır. Amacımız burada SC nakli tam sıçan spinal kord transeksiyon modeli sonucunu iyileştirmek için boru tasarımlar araştırabilirsiniz yöntemleri tarif etmektir.

Protocol

dişi yetişkin Fischer rats (180-200 g vücut ağırlığı) NIH ve USDA kurallarına göre yer alır. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi tüm hayvan prosedürleri onayladı. 1. transplantasyon öncesi hazırlık boru hazırlık. 5 mm uzunluğunda bir diseksiyon mikroskop altında #10 bıçak kullanarak için Boru kesme. Not: Boru iç çapı 2.4-2.7 mm arasında olduğunu; dış çapı 2,5-2,8 mm arasında old…

Representative Results

Bu cerrahi tekniği kullanarak yapılandırılmış boru ve tamamlanan geçmiş spinal kordonlar içine nakli sonra SC fonksiyonu maksimize enjekte edilebilir matris kullanımını değerlendirmek için hedeftir. Üç hafta sonra nakli, hayvanların % 4 paraformaldehyde ile derin ve spinal sütunlar fena halde disseke ve başka bir 24 h için aynı sabitleştirici sabit. Spinal kord sonra disseke ve örnekleri cryostat sagittal bölümleri için cryoprotection için % 30 Sükroz çözüm …

Discussion

Bir etkili transeksiyon model oluşturmanın en kritik adımı omurilik bir ya da iki kesim severing. Rostral ve Kaudal omurilik kütükleri arasında bir 2-2.5 mm boşluk transeksiyon sitede bulunması gerekir. Böyle bir boşluk değil gözükmek için üç en olası nedenleri (1) dorsal/ventral kökleri düzgün kaldırılmadı, ventral (2 dura yeterince kaldırılmadı ve/veya (3 hayvan düzgün onu yerleştirilen tekerleği yerleştirildi değil vardır.

Bir etkili boru ekleme kütükleri…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Viral vektör ve hayvan çekirdek tedavi felç için Miami Projesi’nde lenti-GFP-virüs ve sağlayan hayvan bakımı, sırasıyla, üreten ve Histoloji ve çekirdek görüntüleme için cryostat, confocal mikroskop, kullanım için teşekkür etmek istiyorum ve Stereo araştırmacı ile floresan mikroskop. Finansman NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) ve NSF (DMR-1006510) tarafından sağlandı. M.B. Bunge Christine E Lynn ayırt edici Profesör of Neuroscience olduğunu.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure
check_url/fr/56077?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image