الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية
Summary
ويصف هذا البروتوكول تلفيق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام التي يمكن تطبيقها للكشف البصري للأحماض النووية متعددة في اختبار واحد، التي من السهل أن تعمل. واستخدمت مجموعة شعرية في هذا النهج، للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا أهداف متعددة وذات كفاءة عالية.
Abstract
متعدد الأهداف ووقت قصير، ومنهجيات الموارد معقولة للكشف عن الأحماض النووية متعددة في واحد، سهلة لتشغيل الاختبار مطلوبة على وجه السرعة في تشخيص الأمراض، ورصد العوامل الجرثومية، الكشف عن الكائنات الحية المعدلة وراثيا (جينياً)، و تحليل الطب الشرعي. التي وصفناها سابقا منهاج تسمى الهدوء (جأبيلاري أعلى أساس ررأى Lصافية بوساطة متحاور التضخيم مأولتيبليكس البصرية الكشف عن الأحماض النووية). وهنا، يصف لنا تلفيق محسنة وعمليات الأداء لهذا النظام الأساسي. وهنا نطبق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام يجمعها الصفيف الشعرية للكشف البصري متعدد من الأحماض النووية. الصفيف الشعرية ما قبل المعالجة في نمط مسعور وماء قبل تحديد مجموعات التمهيدي بوساطة حلقة التضخيم متحاور (المصباح) في الشعيرات الدموية. بعد التجميع محول التحميل، تحميل خليط رد مصباح ومعزولة في كل شعري، بسبب القوة الشعرية بخطوة واحدة بيبيتينج. مصباح ردود أفعال تتم بالتوازي في الشعيرات الدموية. النتائج بصريا تلا بالإضاءة مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد. باستخدام هذا البرنامج، علينا أن نبرهن على رصد 8 كثيرا ما تظهر العناصر والجينات في عينات الكائنات المعدلة وراثيا بخصوصية عالية وحساسية. وباختصار، يهدف منهاج العمل الموضحة هنا تيسير الكشف عن الأحماض النووية متعددة. ونحن نعتقد أنه سيكون التطبيق على نطاق واسع في المجالات التي يكون مطلوباً فيها تحليل الحمض النووي الفائق.
Introduction
نظم منخفضة التكلفة وسريعة وسهلة الاستخدام للكشف عن الأحماض النووية متعددة متزامنة هناك حاجة ماسة في طائفة واسعة من المجالات، مثل التشخيص السريري1،2،3، الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا4، 5،6، الميكروبية رصد7،،من89وتحليل الطب الشرعي10،11، واختبارات خاصة نقطة من الرعاية (بوكتس)، حيث الموارد هي عادة ما تكون محدودة12،،من1314.
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بما في ذلك أساليب مشتقة PCR الوقت الحقيقي وبكر متعدد، هو أسلوب المطبقة على نطاق واسع للكشف في هذه الميادين. ومع ذلك، هذه الأساليب عادة سوى الكشف عن هدف واحد في اختبار واحد15 وأنها تتطلب الكهرباء والمعدات الفنية المتطورة.
هو آخر تكنولوجيا واعدة للكشف عن الأحماض النووية بوساطة حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، الذي كان أول من وصف في عام 200016. مصباح كفاءة عالية طريقة الكشف عن الحمض النووي. نظرياً، تضخيم من النسخة 1 إلى 109 نسخ من أمبليكونس في غضون ساعة واحدة، كل إجراء في درجة حرارة ثابتة، (أيبين 60-65 درجة مئوية). التضخيم ناجحة سوف تنتج كمية كبيرة من بيروفوسفات ثانوي غير قابلة للذوبان وتسبب تغييرا في تعكر17، الذي يمكن ملاحظته مباشرة بالعين المجردة. ويمكن أيضا ملاحظة تغيير لون بإضافة أيونات معدنية أو صبغات الفلورسنت مثل18و صبغ الحمض النووي19هيدروكسيل نافثول الأزرق20كالسين. بسبب مزايا عالية الحساسية، وتسهيلا للعملية، ويجري تطبيق مصباح على نطاق واسع في الكشف عن الحمض النووي.
حاليا، هناك أساسا استراتيجيتين لفحوصات مصباح متعدد. واحد لإجراء فحوصات مصباح متعددة بوجود مصباح متعددة تعيين التمهيدي في أنبوب واحد21،،من2223. ومع ذلك، ستكون محدودة التعدد وكفاءة التضخيم تدخل الذاتية والمنافسة بين مجموعات مختلفة من التمهيدي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون من الصعب تحديد منتجات مصباح مختلفة في نفس رد الفعل. استراتيجية أخرى يستند إلى العزلة المادية. مجموعات مختلفة من التمهيدي كانت معزولة في المقصورات المنمنمة الفردية، وردود الفعل مصباح متعددة ثم تتم في وقت واحد24،25. هذه الطرق، التي تستند بوجه عام إلى رقائق موائع جزيئية، توفر حلاً محتملة لردود فعل مصباح الفائق. تصنيع الرقائق وطلاء متعدد قبل مجموعات التمهيدي غير المعقدة، التي قد تزيد من التكاليف وتقليل إمكانية تكرار نتائج.
في الآونة الأخيرة، عدد قليل من الدراسات قد وصف ردود الفعل مصباح المنفذ في الشعيرات الدموية لتجاوز تصنيع رقائق موائع جزيئية معقدة وقد حققت الكشف منخفضة التكلفة26،27. فيما يتعلق بالتحليل الفائق، وهذه الشعيرات الدموية غير مشابهة لإصدارات مصغرة من أنابيب قطاع بكر، نظراً للعينات ورد فعل الكواشف (بما في ذلك مجموعات مختلفة التمهيدي) يجب إعداد فردياً وتسليمها إلى مختلف رد فعل الوحدات داخل الشعيرات الدموية. لتحقيق تحليل متعدد ومتوازية، معدات إضافية، على سبيل المثال مضخة الحقن متعددة القنوات، مطلوب لتحميل موازية للعينات أو المواد الكاشفة.
للتغلب على القيود المرتبطة بالأساليب الحالية للكشف عن تعدد الإرسال من الأحماض النووية، قمنا بتطوير منصة المنمنمة الذي يجمع بين التكنولوجيا البصرية ومصباح مع مجموعة شعرية. هذا البرنامج متعدد الأهداف، مدمجة الحجم، منخفضة التكلفة، وسهلة لتشغيل28. هنا، نحن تصف تفاصيل كيفية اختﻻق الصفيف الشعرية والقيام بردود فعل مصباح في الصفيف. وقد تم توحيد البروتوكول الموصوفة هنا استخدام الكشف عن الكائنات الحية المعدلة وراثيا (جينياً) كنموذج. الأهم من ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في الكشف عن الفائق لأهداف أخرى الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهر منهاج الهدوء هنا، الذي يجمع بين التكنولوجيا مصباح مع مجموعة شعرية، تمكن من كشف المتزامن لأهداف متعددة الجينات المتعلقة بالكائنات المعدلة وراثيا في واحدة والفعالة للغاية وسهلة لتشغيل الاختبار.
لنجاح تنفيذ ردود فعل مصباح متعدد في الكاسيت، ثلاث نقاط حرجة بحاجة إلى أن ي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة في الجزء “الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة الصين الإعانات” (31370813، 3147670، 31670831، و 31600672،)، “المعدلة وراثيا النباتية الخاصة الصندوق الوطني” (2016ZX08012-003، 2016ZX08012-005)، وبرنامج “المواهب الممتازة القرن الجديدة” في جامعة، والبحوث الأساسية الوطنية ومشروع تنمية في الصين (2016YFA0500601) ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (2016 م 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
