Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire
Summary
Ce protocole décrit la fabrication d’une cassette de petite, prêt à l’emploi qui peut être appliquée pour la détection visuelle de plusieurs acides nucléiques lors d’un test unique, qui est facile à utiliser. Dans cette approche, une gamme capillaire a été utilisée pour multiplexe et très efficace de détection des cibles de l’OGM.
Abstract
Multicibles, peu de temps et ressources-abordable méthodes pour la détection des acides nucléiques multiples en un seul, facile à utiliser le test sont urgent dans le diagnostic des maladies, la surveillance microbienne, la détection de l’organisme génétiquement modifié (OGM), et analyse médico-légale. Nous avons déjà décrit la plateforme appelée calme (Capillary Aaxée sur les Maya Loop-mediated amplification isotherme pour Multiplex de détection optique des acides nucléiques). Nous décrivons ci-après, fabrication améliorée et des processus de performance pour cette plateforme. Ici, nous appliquons une cassette petite, prêt-à-utiliser Assemblée par matrice capillaire pour multiplexe détection visuelle d’acides nucléiques. Le tableau capillaire est pré-traité dans un modèle hydrophobe et hydrophile avant de fixer les amorces amplification isotherme boucle-négociée (lampe) dans les capillaires. Après le montage de l’adaptateur de chargement, le mélange réactionnel lampe est chargé et isolé dans chaque capillaire, en raison de la force capillaire par une seule étape de pipetage. Les réactions de la lampe sont exécutées en parallèle dans les vaisseaux capillaires. Les résultats sont lus visuellement par un éclairage avec une lampe de poche UV à main. En utilisant cette plateforme, nous démontrons suivi de 8 apparaissant fréquemment des éléments et des gènes dans les échantillons de l’OGM avec sensibilité et une spécificité élevée. En résumé, la plate-forme décrite ci-après est destinée à faciliter la détection des acides nucléiques multiples. Nous pensons que ce sera largement applicable dans des domaines où l’analyse des acides nucléiques haut débit est requise.
Introduction
Des systèmes peu coûteux, rapides et facile à utiliser pour la détection simultanée de plusieurs acides nucléiques sont nécessaires d’urgence dans un large éventail de domaines, tels que les diagnostics cliniques1,2,3, OGM détection4, 5,6, microbienne surveillance7,8,9, analyse médico-légale10,11et surtout point-of-care tests (POCTs), où des ressources sont habituellement limitées12,13,14.
Amplification génique (PCR), y compris ses dérivés méthodes PCR en temps réel et PCR multiplex, est la technique la plus largement appliquée pour détecter dans ces domaines. Cependant, ces méthodes typiquement seulement détectent une cible dans un test15 et dont ils ont besoin d’électricité et équipements professionnels sophistiqués.
Une autre technologie prometteuse pour la détection des acides nucléiques est boucle-mediated amplification isotherme (lampe), qui a été décrite en 200016. LAMP est une méthode de détection de l’ADN à rendement élevé. Théoriquement, il peut amplifier de 1 exemplaire à 109 copies des amplicons dans l’heure, toutes réalisées à une température constante, (c.-à-d., entre 60 et 65 ° C). Amplification réussie produira une grande quantité du pyrophosphate de sous-produit insoluble et provoquer un changement de turbidité17, ce qui pourrait être directement observée à le œil nu. Un changement de couleur peut également être observé par l’addition d’ions métalliques ou des colorants fluorescents comme calcéine18, acide nucléique colorant19et hydroxyle naphtol bleu20. En raison des avantages de haute sensibilité et la commodité d’opération, lampe est largement appliquée dans la détection des acides nucléiques.
Actuellement, il y a essentiellement deux stratégies pour les dosages de lampe multiplex. On doit effectuer plusieurs essais de lampe en ayant plusieurs lampe apprêt définit dans un tube21,22,23. Cependant, la multiplicité et l’efficacité de l’amplification seraient limitées par l’interférence intrinsèque et la concurrence entre les différentes amorces. En outre, il peut être difficile d’identifier les différents produits de lampe dans la même réaction. Une autre stratégie repose sur l’isolement physique. Différentes amorces ont été isolées dans différents compartiments miniaturisés, et des réactions multiples de lampe sont ensuite exécutées simultanément24,25. Ces approches, qui sont généralement basées sur les puces microfluidiques, offrent une solution potentielle pour les réactions de lampe haut débit. Cependant, la fabrication des chips et du revêtement de pré multiplex des amorces sont compliqués, qui peut augmenter les coûts et réduire le reproductibilité.
Récemment, quelques études ont décrit performante lampe réactions dans les capillaires de contourner la fabrication compliquée de puces microfluidiques et ont atteint des détection faible coût26,27. Toutefois, en ce qui concerne l’analyse de haut-débit, ces capillaires sont semblables à des versions miniatures des tubes PCR de bande, car les échantillons et les réactifs de la réaction (y compris les différentes amorces) doivent être préparés et livrés à différents individuellement unités de réaction dans les capillaires. Pour réaliser une analyse parallèle et multiplexe, équipement supplémentaire, par exemple une pompe à seringue multicanaux, est requis pour le chargement parallèle des échantillons ou des réactifs.
Pour surmonter les limitations associées aux méthodes actuelles de détection multiplexe d’acides nucléiques, nous avons développé une plate-forme miniaturisée qui combine la technologie de lampe visuelle avec une gamme capillaire. Cette plate-forme est multi-cibles, compact dans la taille, faible coût et facile à utiliser de28. Ici, nous décrivons les détails de comment fabriquer la matrice capillaire et effectuer les réactions de la lampe dans le tableau. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant la détection de l’organisme génétiquement modifié (OGM) comme modèle. Ce qui est important, ce protocole permet également à haut débit détection d’autres cibles de l’acide nucléique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plate-forme calme a démontré ici, qui combine la technologie de la lampe avec une gamme capillaire, permet la détection simultanée de multiples liées aux OGM gènes cibles en une seule, très efficace et facile à utiliser le test.
Pour réaliser avec succès les réactions multiplexes de la lampe dans la cassette, trois points critiques ont besoin de se faire remarquer. Tout d’abord, atteindre la même hauteur pour la partie supérieure des capillaires et le modèle hydrophile et hy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en partie par National Natural Science Foundation de Chine subventions (31370813, 3147670, 31670831 et 31600672,), la National fonds spécial de plantes transgéniques (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programme pour le nouveau siècle excellents Talents dans Université, clé National de recherche et projet de développement de Chine (2016YFA0500601) et la Chine postdoctorales Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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