Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares
Summary
Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.
Abstract
Múltiples destinos, a corto plazo y recursos asequibles metodologías para la detección de los ácidos nucleicos múltiples en un único, fácil de operar prueba se necesitan urgentemente en la diagnosis de la enfermedad, vigilancia microbiana, detección de organismo genéticamente modificado (OGM), y Análisis forense. Anteriormente hemos descrito la plataforma llamada calma (Capillary Array basado en Lprogramación orientada a objetos-mediada isoterma amplificación para Multiplex visual detección de ácidos nucleicos). Adjunto, describimos mejor fabricación y procesos de funcionamiento de esta plataforma. Aquí, aplicamos un casete pequeño, listo para su uso por matriz capilar para multiplex visual detección de ácidos nucleicos. La matriz capilar es pretratada en un patrón hidrofóbico e hidrofílico antes de fijar la amplificación isotérmica mediada lazo (lámpara) primer sets en tubos capilares. Después del montaje del adaptador de carga, mezcla de reacción de la lámpara es cargada y aislada en cada capilar, debido a la fuerza capilar por un solo paso de pipeteo. Las reacciones de la lámpara se realizan en paralelo en los capilares. Los resultados se leen visualmente hacia fuera iluminarse con una linterna de UV de mano. Usando esta plataforma, se demuestra control de 8 que con frecuencia aparecen elementos y genes en muestras de OMG con sensibilidad y alta especificidad. En Resumen, la plataforma descrita en este documento se pretende facilitar la detección de ácidos nucleicos múltiples. Creemos que será ampliamente aplicable en campos donde se requiere el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento.
Introduction
Sistemas de bajo costo, rápidos y fácil de usar para la detección simultánea de varios ácidos nucleicos se necesitan urgentemente en una amplia gama de campos, tales como diagnósticos clínicos1,2,3, detección de OGM4, 5,6, microbiana control7,8,9, análisis forense10,11y pruebas especialmente point-of-care (POCTs), donde recursos son generalmente limitada12,13,14.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo sus derivados métodos de PCR en tiempo real y PCR multiplex, es la técnica más ampliamente aplicada para la detección en estos campos. Sin embargo, estos métodos por lo general sólo detectan un objetivo en una prueba de15 y requieren electricidad y equipo sofisticado.
Otra tecnología prometedora para la detección de ácidos nucleicos es mediada por el ciclo isotérmica amplificación (lámpara), que primero fue descrita en 200016. La lámpara es una método de detección de ADN de alta eficiencia. Teóricamente, puede amplificar de 1 copia a 109 copias de amplicones dentro de una hora, todo se realiza a una temperatura constante, (es decir, entre 60-65 ° C). Exitosa amplificación producirá una gran cantidad del pirofosfato insolubles subproducto y causar un cambio en la turbidez17, que podría ser observado directamente por el ojo desnudo. También se pueden observar un cambio de color por la adición de iones metálicos o colorantes fluorescentes como calceína18ácido nucleico tinte19y del oxhidrilo naftol azul20. Debido a las ventajas de alta sensibilidad y comodidad de operación, la lámpara se está aplicando ampliamente en la detección de ácidos nucleicos.
Actualmente, hay principalmente dos estrategias para los ensayos multiplexores de lámpara. Uno es para realizar múltiples ensayos de lámpara por tener múltiples lámpara cartilla establece en un tubo21,,,2223. Sin embargo, la multiplicidad y la eficiencia de amplificación serían limitadas por la interferencia intrínseca y la competencia entre sistemas diferentes de primer. Además, puede ser difícil de identificar los diferentes productos de lámpara en la misma reacción. Otra estrategia se basa en el aislamiento físico. Primer diferentes conjuntos fueron aislados en compartimentos individuales, miniaturizados y múltiples reacciones de lámpara entonces se realizan simultáneamente24,25. Estos enfoques, que generalmente se basan en chips de microfluídica, proporcionan una solución potencial para las reacciones de la lámpara de alto rendimiento. Sin embargo, la fabricación de los chips y la pre-capa múltiplex de primer conjuntos es complicado, que puede aumentar los costos y disminuir la reproducibilidad.
Recientemente, algunos estudios han descrito realizar reacciones de lámpara en tubos capilares para evadir la complicada fabricación de chips microfluídicos y lograron la detección de bajo costo26,27. Sin embargo, con respecto al análisis de alto rendimiento, estos capilares son similares a las versiones en miniatura de PCR tira tubos, porque las muestras y los reactivos de la reacción (incluyendo el primer diferentes conjuntos) deben ser individualmente preparados y entregados a diferentes unidades de reacción dentro de los capilares. Para lograr el análisis paralelo y multiplex, equipo adicional, por ejemplo una bomba de jeringa multicanal, se requiere para carga paralelo de muestras o reactivos.
Para superar las limitaciones asociadas con los métodos actuales de detección multiplex de ácidos nucleicos, hemos desarrollado una plataforma miniaturizada que combina tecnología de lámpara visual con una gama capilar. Esta plataforma es multi-target, compacto, bajo costo y fácil de operar28. Adjunto, describimos los detalles de cómo fabricar la matriz capilar y realizar las reacciones de la lámpara de la matriz. El protocolo descrito aquí ha sido estandarizado utilizando detección de organismo genéticamente modificado (OGM) como modelo. Lo importante, este protocolo también puede utilizarse en la detección de alto rendimiento de otros objetivos de ácidos nucleicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plataforma calma demostrado aquí, que combina la tecnología de lámpara con una matriz capilar, permite la detección simultánea de múltiples objetivos de genes relacionados con OMG en una única, altamente eficaz y fácil de operar prueba.
Para realizar con éxito las reacciones multiplexores de la lámpara en el cassette, tres puntos críticos deben ser notado. En primer lugar, alcanzar la misma altura de la parte superior de los capilares y el patrón hidrofílico e hidrofóbico de l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado en parte por nacional Ciencia Natural de China subvenciones de la Fundación (31370813, 3147670, 31670831 y 31600672,), los transgénicos vegetales especiales Fondo Nacional (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programa de nuevos talentos excelente de siglo en Universidad, la clave nacional de investigación y proyecto de desarrollo de China (2016YFA0500601) y la Fundación China de ciencia Postdoctoral (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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