Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer kleinen, Ready-to-Use Kassette, die für die visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Einzeltest können, die einfach angewendet werden zu bedienen ist. Bei diesem Ansatz wurde ein Kapillar Array für multiplex und hocheffiziente Nachweis von GVO Ziele verwendet.
Abstract
Multi-Target, kurze Zeit und Ressource-kostengünstige Methoden zum Nachweis von mehreren Nukleinsäuren in einem einzigen, einfach zu bedienen Test sind dringend notwendig, in der Diagnose von Krankheiten, mikrobielle Überwachung, gentechnisch veränderter Organismus (GVO)-Erkennung, und forensische Analysen. Zuvor haben wir die Plattform namens Ruhe (CApillary ARray-basierten LOop-vermittelten isothermen Verstärkung für MUltiplex visuelle Erkennung von Nukleinsäuren) beschrieben. Hier beschreiben wir verbesserte Fertigung und Leistungsprozesse für diese Plattform. Hier wenden wir eine kleine, Ready-to-Use Kassette von Kapillar Array für Multiplex-visuelle Erkennung von Nukleinsäuren montiert. Das Kapillare Array ist vor der Befestigung Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Grundierung Sätze in Kapillaren vorbehandelt in einer hydrophoben und hydrophilen Muster. Nach der Montage des Adapters laden Lampe Reaktionsgemisch geladen und isoliert in jede Kapillare durch Kapillare Kraft von einem Arbeitsschritt pipettieren. Die Lampe Reaktionen erfolgen parallel in den Kapillaren. Die Ergebnisse werden visuell durch Beleuchtung mit einer handgeführten UV-Taschenlampe ausgelesen. Mit Hilfe dieser Plattform, zeigen wir die Überwachung von 8 häufig erscheinende Elemente und Gene in GVO Proben mit hoher Spezifität und Sensitivität. Zusammenfassend lässt sich sagen die hierin beschriebene Plattform sollen die Aufdeckung von mehreren Nukleinsäuren zu erleichtern. Wir glauben, es wird breit einsetzbar in Bereichen wo Hochdurchsatz-Nukleinsäure-Analyse erforderlich ist.
Introduction
Kostengünstige, schnelle und einfach zu bedienen-Systeme für die simultane Detektion von mehreren Nukleinsäuren werden in den unterschiedlichsten Bereichen wie klinische Diagnostik1,2,3, GVO-Erkennung4dringend, 5,6, mikrobielle Überwachung7,8,9, forensische Analysen10,11und vor allem Point-of-Care-Tests (POCTs), wo Ressourcen sind in der Regel12,13,14.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einschließlich seiner abgeleiteten Methoden Real-Time PCR und Multiplex-PCR, ist die am häufigsten angewandte Technik zur Erkennung in diesen Bereichen. Aber diese Methoden erkennen in der Regel nur ein Ziel in einem Test15 und sie benötigen Strom und anspruchsvolle professionelle Ausrüstung.
Eine weitere viel versprechende Technologie zur Erkennung von Nukleinsäuren ist Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe), die erstmals im Jahr 200016beschrieben wurde. Lampe ist eine hocheffiziente Methode der DNA-Nachweis. Theoretisch kann es ab 1 Exemplar 109 Kopien der Amplifikate innerhalb einer Stunde alle durchgeführt bei einer konstanten Temperatur (d.h.zwischen 60-65 ° C) verstärken. Erfolgreiche Verstärkung produzieren eine große Menge an unlöslichen Nebenprodukt Pyrophosphat und bewirken eine Trübung17, die direkt mit dem bloßen Auge beobachtet werden konnte. Eine Farbänderung kann auch durch die Zugabe von Metallionen oder fluoreszierende Farbstoffe wie Calcein18, Nukleinsäure-Farbstoff19und Hydroxyl-Naphthol Blau20beobachtet werden. Aufgrund der Vorteile der hohen Empfindlichkeit und Bedienkomfort ist Lampe weithin in Nukleinsäure-Erkennung eingesetzt.
Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Strategien für Multiplex-Lampe-Assays. Eine mehrere Lampe Tests durchführen, indem er mehrere Lampe soll Primer setzt in einem Rohr21,22,23. Jedoch würde die Vielzahl und die Effizienz der Verstärkung durch die inneren Störungen und Wettbewerb zwischen den verschiedenen Grundierung Sätze begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, verschiedene LAMP-Produkte in der gleichen Reaktion zu identifizieren kann. Eine andere Strategie basiert auf physische Isolierung. Verschiedene Primer-Sets wurden in einzelnen miniaturisierte Kompartimente isoliert, und mehrere Lampe Reaktionen erfolgen dann gleichzeitig24,25. Diese Ansätze, die in der Regel auf mikrofluidischen Chips basieren, bieten eine mögliche Lösung für Hochdurchsatz-Lampe Reaktionen. Die Herstellung der Chips und die Multiplex-Pre-Beschichtung der Primer-Sets ist jedoch kompliziert, kann die Kosten erhöhen und Reproduzierbarkeit zu verringern.
Vor kurzem, haben einige Studien beschrieben leistungsstarke Lampe Reaktionen in Kapillaren zu umgehen die komplizierte Herstellung von mikrofluidischen Chips und kostengünstige Erkennung26,27erreicht haben. Sind jedoch in Bezug auf Hochdurchsatz-Analyse, diese Kapillaren ähnlich wie Miniaturausgaben der PCR-Streifen Röhren, weil die Proben und Reaktion Reagenzien (einschließlich der verschiedenen Primer-Sets) müssen individuell vorbereitet und an verschiedenen geliefert Reaktionseinheiten in Kapillaren. Um parallel und Multiplex-Analyse zu erreichen, ist Zusatzausstattung, z. B. eine Mehrkanal-Spritzenpumpe für parallel Laden von Proben oder Reagenzien benötigt.
Um die Grenzen verbunden mit den aktuellen Methoden für Multiplex-Detektion von Nukleinsäuren zu überwinden, haben wir eine miniaturisierte Plattform entwickelt die visuelle Lampentechnologie mit einem Kapillar Array kombiniert. Diese Plattform ist Multi-Target, kompakt, kostengünstig und einfach zu bedienen28. Hier beschreiben wir die Details wie das Kapillare Array herzustellen und die Lampe Reaktionen im Array durchführen. Das hier beschriebene Protokoll wurde mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) Erkennung als Modell vereinheitlicht. Wichtig ist, kann dieses Protokoll auch im Hochdurchsatz-Erkennung von anderen Nukleinsäure-Ziele verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ruhige Plattform demonstriert hier, welche verbindet die Lampen-Technologie mit einem Kapillar Array, ermöglicht die simultane Detektion von mehrere gen GVO-bezogenen Ziele in einem einzigen, äußerst effektiv und einfach zu bedienen Test.
Um erfolgreich die Multiplex-Lampe-Reaktionen in der Kassette durchzuführen, müssen drei kritische Punkte zu beachten. Erstens erreichen die gleiche Höhe für die Oberseite der Kapillaren und die hydrophile und hydrophobe Muster des Kapillar-Arrays …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch die National Natural Science Foundation von China Stipendien (31370813, 3147670, 31670831 und 31600672,), die nationale transgene Pflanze Sonderfonds (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Programm für neue Jahrhundert hervorragende Talente in finanziert Universität, nationale Forschungsschwerpunkte und Entwicklungsprojekt von China (2016YFA0500601) und China Postdoc Wissenschaftsstiftung (2016M 591667).
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
