모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Summary

이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.

Abstract

다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.

Introduction

여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단^1,2,3, GMO 검출^{4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6},^7,,89, 정밀 분석^10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한^12,,1314있습니다.

연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포함 하 여 검출이 분야에 가장 널리 적용된 기술입니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 검색 한 대상 한 테스트¹⁵ 및 전기 및 정교한 전문 장비 필요한.

핵 산 탐지 하기 위한 또 다른 유망한 기술이 이다 루프 중재 등온 증폭 (램프)는 처음 2000¹⁶에 설명 했다. 램프는 고효율 DNA 검출 방식 이다. 이론적으로, 그것은 수 있는 증폭 1 복사본에서 amplicons 10⁹ 복사본을 일정 한 온도, (즉, 60-65 ° C 사이)에서 모두 1 시간 이내. 성공적인 증폭 불용 성 부산물 파이 인산의 대량 생산 하 고 탁도¹⁷, 맨 눈으로 직접 관찰 될 수 있는 변경 될 것입니다. 색상 변화는 또한 금속 이온 또는 Calcein¹⁸, 핵 산 염색¹⁹, hydroxyl naphthol 블루²⁰등 형광 염료의 추가 의해 관찰할 수 있습니다. 높은 감도의 장점과 운영의 편의 때문에 램프는 핵 산 탐지에서 넓게 적용 되 고.

현재, 다중 램프 분석 실험을 위한 주로 두 가지 전략이 있다. 하나는 여러 개의 램프를 갖는 다중 램프 분석 수행 하는 뇌관 1 개의 관^21,,2223에 설정 합니다. 그러나, 복합성 및 증폭 효율 본질적인 간섭 및 다른 뇌관 세트 간의 경쟁에 의해 제한 될 것 이다. 또한, 그것은 다른 램프 제품 같은 반응에 어려울 수 있습니다. 또 다른 전략은 물리적 격리를 기반으로 합니다. 다른 뇌관 세트 개별 소형된 구획으로 고립 되었다 및 다중 램프 반응을 동시에 수행 됩니다 다음^24,25. 미세 칩에 따라 일반적으로, 이러한 접근 높은 처리량 램프 반응에 대 한 잠재적인 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 칩의 제조 및 뇌관 세트의 다중 사전 코팅은 복잡, 비용 증가 재현성을 줄일 수 있습니다.

최근, 몇 가지 연구는 미세 칩의 복잡 한 제조를 무시 하 고 저 비 탐지^26,27달성에 모 세관에서 수행 램프 반응을 설명 했습니다. 그러나, 높은 처리량 분석에 관해서는 이러한 모세 혈관은 비슷합니다 PCR 스트립 튜브의 미니어처 버전 샘플 및 반응 시 약 (를 포함 하 여 다른 뇌관 세트) 개별적으로 준비 하 고 해야 합니다 다른에 게 전달 하기 때문에 모세 혈관 내에서 반응 단위입니다. 병렬 및 다중 분석을 달성 하기 위해 추가 장비, 예를 들어 멀티 채널 주사기 펌프는 샘플 또는 시 약의 병렬 로드에 대 한 필요 합니다.

핵 산의 다중 검출을 위한 현재 메서드에 연결 된 한계를 극복 하기 위해 우리 모 세관 배열로 시각적 램프 기술을 결합 하는 소형된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼은 다중 대상, 소형 크기, 낮은 비용, 그리고²⁸를 운영 하 게 쉬운. 여기, 모 세관 배열 조작 배열에 램프 반응을 수행 하는 방법의 세부 사항을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 모델 유전자 변형된 유기 체 (GMO) 검출을 사용 하 여 표준화 되어 있다. 중요 한 것은,이 프로토콜 다른 핵 산 대상의 높은 처리량 검색에도 사용할 수 있습니다.

Protocol

참고: 베어링 원하는 마이크로 채널 및 로딩 어댑터에 대 한 셰이프 스테인리스 형 되었습니다 이미이 프로토콜 가정 (3D 파일 추가 파일 1로 제공 됩니다과 2. ). 이 프로토콜은 또한 그 식물 DNA 분리 이미 실시 되었습니다 가정 합니다. 1. 모 세관 배열 기반 준비-사용 카세트의 제작 스테인리스 스틸 금형 청소. 잠재적인 오염 ?…

Representative Results

이 방법에서는, 그것은 샘플 로드 하는 동안 다른 모세 혈관 간의 교차 오염을 방지 하는 것이 중요입니다. 이 개별 모 세관에 뇌관을 유지 수 있는 키토 산 도입 되었다. 그것은 일 또는 하지 여부를 테스트 하려면 우리 미리 고정 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 뇌관 “T”와 “U”의 패턴으로 모 세관 카세트에 설정에서 볼 수 있듯이 그림 3a. <…

Discussion

진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.

카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모?…

Materials

UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
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