Summary

В сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа тканей протеома человека Аденома гипофиза двумерного гель-электрофорез

Published: April 02, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) для разделения и идентификации ткани протеома человека Аденома гипофиза, который представляет шаблон хороший и воспроизводимые 2DE. Многие белки наблюдаются в каждом месте 2DE при анализе протеома комплекс рака с использованием MS высок чувствительности.

Abstract

Аденома гипофиза человека (ПА) является распространенной опухоли, что происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных орган и могут быть классифицированы как клинически функциональных или нефункциональным ПА (FPA и NFPA). NFPA трудно для ранней стадии диагностики и терапии благодаря едва подъемные гормонов в крови, по сравнению с FPA. Нашей долгосрочной целью является использование методов протеомики для обнаружения надежных биомаркеров для уточнения ПА молекулярных механизмов и признание эффективного диагностические, прогностические маркеры и терапевтических целей. Эффективное двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) методы были представлены здесь для анализа человеческого протеомов ПА, включая подготовку образцов, 2D электрофорез, белок визуализации, анализа изображений, в гель Пищеварение трипсина, пептид массового отпечатков пальцев (PMF) и тандем массы спектрометрия (МС/МС). 2-мерной гель электрофореза при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрия PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-жидкостная хроматография (LC) МС/МС процедуры успешно применялись в анализе NFPA протеома. С использованием высокой чувствительности масс-спектрометр многие белки были определены с помощью метода 2DE-LC-MS/MS в каждом 2D гель пятно в анализе сложных ПА ткани для максимального охвата человеческого ПА протеома.

Introduction

ПА является распространенной опухолью, которая происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных органа, которые играют важную роль в эндокринной системы человека. PA включает в себя клинические функциональные и нефункциональные PAs (FPA и NFPA)1,2. NFPA затруднено в ранней стадии диагностики и терапии из-за уровня только слегка повышенной гормонов (например, ЛГ и ФСГ) в крови, по сравнению с FPA, который значительно возрос уровень соответствующих гормонов в крови3,4 ,5. Уточнение молекулярных механизмов и открытие эффективных биомаркеров имеет важное клиническое значение в диагностике, терапии и прогноз NFPA. Наша долгосрочная цель заключается в том, чтобы развивать и использовать proteomic методы для изучения NFPA для открытия надежной биомаркеров для уточнения его молекулярные механизмы и признать эффективных терапевтических целей, а также диагностических и прогностических маркеров. 2-де, в сочетании с MS методы широко используются в нашей долгосрочной программы исследований относительно человека ПА протеома1,2,6,7, включая создание протеома ссылки карты в3,8, анализ дифференциально выраженным белком профили9,10,11,12,13, гормон варианты14 ,15, столб-поступательные изменения таких фосфорилирования тирозина и14 азотирования16,17,18, протеомических вариации инвазивных относительно Неинвазивный NFPAs19и протеомных неоднородность NFPA подтипы13, которое привело к открытию нескольких важных путь сетей (митохондриальной дисфункции, регуляции клеточного цикла, оксидативный стресс и MAPK сигнализации системы аномалии), изменяются в NFPA13,19,20.

2DE отделяет протеины согласно их Изоэлектрическая точка (Пи) (изоэлектрическая упором, МЭФ) и молекулярный вес (через натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. это разделение общего и классической техники в области протеомики, с момента введения концепции протеома и протеомики в 1995 году24. МС является метод решающее значение для выяснения личности отделен 2DE белков, включая стратегии PMF и МС/МС. Очень быстрое развитие инструментов MS, особенно в аспектах чувствительность обнаружения и разрешения, в сочетании с улучшением системы LC, значительно улучшает личность низкий или очень низкий изобилие белков в протеома максимизировать освещение протеома. Она также побуждает наши традиционные концепции, что только один или два белки присутствуют в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и предоставляет возможность выявить несколько белков в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и увеличить охват NFPA протеома.

Здесь мы описываем подробные протоколы 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-LC-MS/MS, которые успешно использовались в анализе человека NFPA протеома. Протоколы включают в себя подготовку образцов, первый аспект (изоэлектрическая упором, ВФВ), второе измерение (SDS-PAGE), Визуализация белков (Серебряные пятная и Окрашивание Кумасси синий), изображение анализ 2D геля, Пищеварение трипсина в гель, Очистка tryptic пептидов, PMF, МС/МС и прижигание3,8,,2526базы данных. Кроме того для анализа других тканей человека протеомов легко переводит этот протокол.

Protocol

Настоящий Протокол следует принципам в Xiangya больнице медицинской этики Комитет Центральный Южный университет, Китая. Головы шапка и перчатки должны носить весь экспериментальной процедуры, чтобы избежать загрязнения кератина от кожи и волос8. 1. подготовка п?…

Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: с экспериментальной процедурой, описанной выше, в общей сложности 150 мкг белка были извлечены из ФСГ выразил NFPA тканей (женщина, 50 лет, АКТГ (-), GH (-), ПРЛ (-), LH (-), ФСГ (+) и ТТГ (-)) и выстроились с 18 см IPG полосы (рН 3-10 NL) и геля SDS-PAGE большого формата, з…

Discussion

2DE, в сочетании с MS методы, включая 2DE-MS PMF и 2DE-MS/MS, успешно используется в нашей долгосрочной программе – использование протеомики для изучения человеческого NFPA proteomic вариации и молекулярных сети вариации для разяснения молекулярных механизмов и Открытие эффективных биомаркеров для NFPAs. …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национального фонда естественных наук Китая (Грант № 81572278 и 81272798 XZ), субсидий из Китая «863» план проекта (Грант № 2014AA020610-1-XZ), Xiangya больница фондов для введения талант (к XZ) и Хунань Фонд провинциального естественных наук Китая (Грант № 14JJ7008 к XZ). Авторы также признают научный вклад д-р Доминик м. Desiderio в центра науки здоровья университета штата Теннесси. X.Z. постоянно разработаны и используются методы 2DE-MS для анализа протеома Аденома гипофиза, начиная с 2001 года, задуманная концепция для настоящей рукописи, написал и пересмотренный рукописи, координировал работу соответствующих и отвечал за финансовая поддержка и соответствующую работу. Ю.л. приняла участие в пересмотре рукописи. Y.H участие в коллекцию ссылок и Редакция рукописи. Все авторы одобрил окончательный вариант рукописи.

Materials

Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
  28. Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
check_url/fr/56739?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

View Video