Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario
Summary
Qui, presentiamo un’elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l’uso di MS ad alta sensibilità.
Abstract
Adenoma pituitario umano (PA) è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell’organo e può essere classificato come PA clinicamente funzionali o non funzionali (FPA e NFPA). NFPA è difficile per diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di a malapena elevando gli ormoni nel sangue rispetto al FPA. Il nostro obiettivo a lungo termine consiste nell’utilizzare metodi di proteomica alla scoperta di biomarcatori affidabili per chiarimento dei meccanismi molecolari di PA e riconoscimento delle efficaci marcatori diagnostici, prognostici e bersagli terapeutici. Efficace elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiato con metodi di spettrometria di massa (MS) sono stati presentati qui per analizzare proteomi PA umani, compresa la preparazione dei campioni, 2D elettroforesi del gel, visualizzazione di proteine, analisi delle immagini, in gel digestione della tripsina, impronta digitale totale del peptide (PMF) e tandem (MS/MS) di spettrometria di massa. 2-dimensional gel elettroforesi matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione spettrometria totale PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS e le procedure di MS/MS cromatografia 2DE-liquido (LC) sono state applicate con successo in un’analisi del proteoma NFPA. Con l’uso di uno spettrometro di massa ad alta sensibilità, molte proteine sono state identificate con il metodo 2DE-LC-MS/MS in ogni gel 2D spot in un’analisi del complesso tessuto di PA per massimizzare la copertura del proteoma umano PA.
Introduction
PA è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell’organo, che svolgono un ruolo importante nel sistema endocrino umano. PA comprende clinicamente funzionali e non funzionali PAs (FPA e NFPA)1,2. NFPA è difficile nella diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di livelli di ormone solo leggermente elevati (ad es., LH e FSH) nel sangue rispetto al FPA, che ha aumentato significativamente i livelli di ormoni corrispondenti nel sangue3,4 ,5. Il chiarimento dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace è importante significato clinico nella diagnosi, terapia e prognosi di NFPA. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare e utilizzare metodi di proteomica per studiare NFPA per la scoperta di biomarcatori affidabili per chiarire i meccanismi molecolari e riconoscere bersagli terapeutici efficaci così come marcatori diagnostici e prognostici. 2-DE accoppiato con metodi MS sono stati ampiamente usati nel nostro programma di ricerca a lungo termine per quanto riguarda umano PA proteoma1,2,6,7, compresa l’istituzione di riferimento proteome Mappe:3,8, analisi di proteine differenzialmente espresse profili9,10,11,12,13, varianti di ormone14 ,15, modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione della tirosina e14 nitrazione16,17,18, la variazione di proteomica di invasivo rispetto al non invadente NFPAs19e l’eterogeneità di proteomica di NFPA sottotipi13, che ha condotto alla scoperta di più reti via importante (disfunzione mitocondriale, disregolazione del ciclo cellulare, stress ossidativo e segnalazione MAPK anomalia di sistema) che vengono modificate in NFPA13,19,20.
2DE separa le proteine secondo il loro punto isoelettrico (pI) (messa a fuoco isoelettrica, IEF) e il peso molecolare (tramite elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. si tratta di una tecnica di separazione classica e comuni nel campo della proteomica, poiché l’introduzione dei concetti del proteoma e la proteomica in 199524. MS è la tecnica fondamentale per scoprire l’identità delle proteine 2DE-separati, comprese strategie di PMF e MS/MS. Il molto rapido sviluppo degli strumenti di MS, soprattutto negli aspetti della sensibilità di rilevazione e risoluzione, in combinazione con il miglioramento del sistema di LC, migliora notevolmente l’identità delle proteine di basso o bassissimo abbondanza in un proteoma per massimizzare la copertura di un proteoma. Essa contesta anche i nostri concetti tradizionali che solo uno o due proteine sono presenti in un gel 2D spot in un’analisi del proteoma di tessuto umano complesso e offre l’opportunità di identificare proteine multiple in un gel 2D spot in un’analisi del complesso tessuto umano proteoma e massimizzare la copertura del proteoma NFPA.
Qui descriviamo protocolli dettagliati di 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS che sono state utilizzate con successo nell’analisi del proteoma umano NFPA. I protocolli prevedono la preparazione di campioni, prima dimensione (messa a fuoco isoelettrica, IEF), seconda dimensione (SDS-PAGE), visualizzazione delle proteine (macchiatura d’argento e la macchiatura blu di Coomassie), analisi del gel 2D, digestione della tripsina in-gel, l’immagine purificazione di peptidi triptici, PMF, MS/MS e database bruciante3,8,25,26. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per l’analisi di altri proteomi di tessuto umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
2de, accoppiato con MS metodi tra cui 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, è stato utilizzato con successo nel nostro programma a lungo termine – l’uso della proteomica per studiare la variazione di proteomica umane NFPA e rete molecolare per la delucidazione dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace per NFPAs. Proteomica comparativa basata su 2DE con buona riproducibilità svolge un ruolo importante nell’identificazione di NFPA proteomica variazioni9,10<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 81572278 e 81272798 a XZ), le sovvenzioni da Cina “863” Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), i fondi di ospedale Xiangya per introduzione di talento (a XZ) e il Hunan Fondazione di scienza naturale provinciale della Cina (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Gli autori riconoscono anche il contributo scientifico del Dr. Dominic M. Desiderio in Health Science Center della University of Tennessee. X.Z. continuamente sviluppato e utilizzato metodi 2DE-MS per analizzare il proteoma di adenoma pituitario a partire dal 2001, concepito il concetto per il manoscritto presente, ha scritto e rivisto il manoscritto, coordinato i lavori pertinenti ed è stato responsabile per la sostegno finanziario e il lavoro corrispondente. Y.L. partecipato revisione del manoscritto. Y.H ha partecipato insieme di riferimenti e revisione del manoscritto. Tutti gli autori approvato il manoscritto finale.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
