ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動
Summary
二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) を人間の下垂体腺腫組織プロテオーム良いと再現可能な 2DE パターンを提示を区別して結合を紹介します。高感度 MS を使って複雑ながんのプロテオームを解析するとき、多くの蛋白質は各 2DE スポットで観察されます。
Abstract
ひと下垂体腺腫 (PA) は、視床下部下垂体標的臓器軸システムのひと下垂体腺で発生し、臨床的に機能または機能しない PA (FPA と NFPA) として分類されるかもしれない一般的な腫瘍です。NFPA は、初期段階の診断とやっと FPA と比較して血液中のホルモンを高めるための治療困難です。私たちの長期的な目標は、PA の分子メカニズムの解明と効果的な診断、予後マーカーや治療標的の認識のための信頼性の高いバイオ マーカーを発見するプロテオミクス メソッドを使用します。効果的な二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) 法と相まってがここで示されたサンプル、第 2 ゲルの電気泳動、タンパク質の可視化、画像解析、ゲルでの準備を含む人間の PA プロテオームの分析トリプシンの消化力、ペプチドマスフィンガー プリント (PMF)、タンデム質量分析 (MS/MS)2 二次元のゲルの電気泳動マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 PMF (2DE MALDI MS PMF) 2DE MALDI MS/MS、および 2DE 液体クロマトグラフィー (LC) MS/MS プロシージャを正常に NFPA プロテオームの解析に適用されています。高感度質量分析計を用いる多くの蛋白質は 2DE-LC ・ MS/MS メソッドを各第 2 ゲル人間 PA プロテオームのカバレッジを最大化する複雑な PA 組織の分析にスポットしました。
Introduction
PA は、ひと下垂体腺で人間の内分泌系で重要な役割を果たす器官の視床下部-下垂体-ターゲット軸システムで発生する一般的な腫瘍です。PA には、臨床的に機能的および非機能的 (FPA と NFPA) PAs1,2が含まれています。NFPA はだけ小高いホルモン レベル (例えばLH と FSH) FPA 血3,4 に対応するホルモンのレベルを増加している大幅に比較して血液中のため初期段階の診断と治療における困難 ,5。分子機構の解明と効果的なバイオ マーカーの発見、診断、治療、および NFPA の予後に重要な臨床的意義。私たちの長期的な目標は、開発しプロテオーム メソッドを使用して、その分子メカニズムを明らかにする信頼性の高いバイオ マーカーの発見のための NFPA の研究し、効果的な治療上のターゲットとして診断と予後マーカーを認識することです。MS 方式と相まって 2 デは人間 PA プロテオーム1,2,6、7、プロテオーム参照の設立を含むに関する長期研究プログラムで広く使用されています。3、8、発現タンパク質プロファイル9,10、11,12,13, ホルモンの亜種14 の分析マップします。 ,15、リン酸化チロシンと14ニトロ化16,17,など18のポスト翻訳の修正、関連する侵襲のプロテオーム変化非侵襲的 NFPAs19、および NFPA サブタイプ13、複数の重要な経路ネットワーク (ミトコンドリア、細胞周期調節不全、酸化ストレス、MAPK シグナルの発見につながったのプロテオームの不均一性システム異常) NFPA13,,1920に変更します。
2DE は、等電点 (pI) (等電集中、IEF) と分子量 (ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動、SDS ページ) 経由で蛋白質を分ける1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. プロテオームと 1995年24プロテオ ミックスの概念の導入以来、プロテオミクスの分野で一般的で古典的な分離技術は、これ。MS は PMF と MS/MS の戦略を含む、2DE で区切られた蛋白質のアイデンティティを見つけることの重要な技法です。検出感度と LC システムの改善との組み合わせで、解像度の面で特に、MS の器械の非常に急速な開発向上を最大化するプロテオームの低または非常に低の豊富な蛋白質のアイデンティティ、プロテオームの報道。それはまた従来の概念を課題に 1 つまたは 2 つのタンパク質が第 2 ゲルの複雑な人体組織のプロテオームの分析にスポットに存在し第 2 ゲルの複雑な人体組織の分析にスポットで複数の蛋白質を識別する機会を提供しますプロテオームと NFPA プロテオームのカバレッジを最大化します。
ここで述べる 2DE MALDI MS PMF、2DE MALDI MS の詳しいプロトコル/MS と 2DE-クロマトグラフィー-タンデム質量人間 NFPA プロテオーム解析で正常に使用されています。プロトコルの準備は、サンプルの最初の寸法 (等電集中、IEF)、2 番目の次元 (SDS-PAGE)、タンパク質 (銀製の汚損とクマシー ブルー染色) の可視化、画像 2次元ゲル、ゲルのトリプシンの消化力の解析3,8,25,26の焼け付くようなデータベース ・ MS/MS、PMF 由来ペプチドの精製。また、このプロトコルは、他の人間の組織のプロテオームの分析のため簡単に変換します。
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE MS PMF と 2DE ・ MS/MS を含む MS 方式と相まって、2DE は正常に私たちの長期的なプログラム – 人間の NFPA プロテオーム変動と分子機構の解明に向けた分子ネットワーク変動を研究するプロテオミクスの使用で使用されているとNFPAs に効果的なバイオ マーカーの発見。再現性の良い 2DE ベースの比較プロテオミクス NFPA プロテオーム変動9,10、<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国家自然科学基金中国 (許可番 81572278 と 81272798 XZ)、中国「863」計画プロジェクト (XZ にグラント号 2014AA020610-1)、才能入門 (XZ)、xiangya の第 3 病院の資金と、湖南省からの補助金によって支えられました。中国の地方の自然科学基礎 (XZ にグラント号 14JJ7008)。著者はまた博士ドミニク M. でテネシー大学健康科学センターでの科学の貢献を認めます。X.Z. 継続的に開発し 2001 年から始まって下垂体腺腫プロテオームを解析する 2DE MS メソッドを使用、現在の原稿のための概念を考案した、書いた原稿に、関連の仕事の調整し、に責任があった、財政支援と対応する作業。Y.L. は、原稿の修正に参加しました。YH は参加する参照のコレクションと原稿の修正。すべての著者は、最終原稿を承認しました。
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
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