Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom
Summary
Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.
Abstract
Menselijke hypofyse-adenoom (PA) is een gemeenschappelijk tumor die voorkomt in de menselijke hypofyse in de as orgaansystemen hypothalamus-hypofyse-gericht, en kan worden aangemerkt als klinisch functionele of deactiveren PA (FPA en NFPA). NFPA is moeilijk voor vroege fase diagnose en therapie toe te schrijven aan de hormonen in het bloed in vergelijking met de FPA nauwelijks te verheffen. Ons langetermijndoel is het gebruik van proteomics methoden om te ontdekken van betrouwbare biomarkers voor verduidelijking van moleculaire mechanismen van PA en erkenning van doeltreffende diagnostische, voorspellende markers en therapeutische doelen. Effectieve tweedimensionale elektroforese van het gel (2DE) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) methoden werden hier gepresenteerd voor het analyseren van menselijke PA-proteomes, met inbegrip van de voorbereiding van de monsters, 2D gelelektroforese, eiwit visualisatie, beeldanalyse, in-gel spijsvertering van de trypsine, peptide massa vingerafdruk (PMF) en tandem massaspectrometrie (MS/MS). 2-dimensionale gel elektroforese laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI-MS/MS en MS/MS-methoden van 2DE-vloeibare chromatografie (LC) met succes zijn toegepast in een analyse van de NFPA Proteoom. Met het gebruik van een hoog-gevoeligheids-massaspectrometer, werden veel eiwitten geïdentificeerd met de 2DE-LC-MS/MS methode in elke plek in een analyse van complexe PA weefsel te maximaliseren van de dekking van menselijke PA Proteoom 2D gel.
Introduction
PA is een gemeenschappelijk tumor dat zich voordoet in de menselijke hypofyse in de hypothalamus-hypofyse-gerichte as orgaansystemen, die een belangrijke rol in de menselijke hormoonhuishouding spelen. PA bevat klinisch functionele en functioneert PAs (FPA en NFPA)1,2. NFPA is moeilijk in de vroege fase diagnose en therapie door slechts licht verhoogde hormoonspiegels (bijvoorbeeldLH en FSH) in het bloed in vergelijking met de FPA, die aanzienlijk niveaus van overeenkomstige hormonen in bloed3,4 verhoogde heeft ,5. De verduidelijking van de moleculaire mechanismen en ontdekking van effectieve biomarkers heeft belangrijke klinische betekenis in de diagnose, therapie en prognose van NFPA. Ons langetermijndoel is te ontwikkelen en gebruiken van proteomic methoden voor de analyse van NFPA voor de ontdekking van betrouwbare biomarkers te verduidelijken van de moleculaire mechanismen en herkennen van effectieve therapeutische doelen evenals diagnostische en prognostische markeringen. 2-DE combinatie met MS-methoden zijn uitgebreid gebruikt in onze lange termijn onderzoeksprogramma met betrekking tot menselijke PA Proteoom1,2,6,7, met inbegrip van de oprichting van Proteoom referentie 3,8, analyse van differentially uitgedrukte proteïnen profielen9,10,11,12,13, hormoon varianten14 kaarten ,15, posttranslationele modificaties zoals fosforylatie14 en tyrosine nitratie16,17,18, de proteomic variatie van invasieve ten opzichte noninvasive NFPAs19, en de heterogeniteit van proteomic NFPA subtypen13, die tot de ontdekking van meerdere belangrijke traject netwerken (mitochondriale dysfunctie, celcyclus disregulatie, oxidatieve stress en MAPK signalering leidde systeem de abnormaliteit) die worden gewijzigd in NFPA13,19,20.
2de scheidt proteïnen volgens hun elektrisch punt (pI) (elektrisch gericht, IEF) en moleculair gewicht (via natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gelelektroforese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dit is een gemeenschappelijke en klassieke scheiding techniek op het gebied van proteomics, sinds de invoering van de begrippen van de Proteoom en proteomics in 199524. MS is de cruciale techniek voor het vinden van de identiteit van de 2DE gescheiden eiwitten, met inbegrip van PMF en MS/MS strategieën. De razendsnelle ontwikkeling van MS instrumenten, met name in de aspecten van detectie gevoeligheid en resolutie, in combinatie met de verbetering van de LC systeem, sterk verbetert de identiteit van de laag of zeer laag overvloed eiwitten in een Proteoom te maximaliseren de dekking van een Proteoom. Het daagt ook onze traditionele concepten dat slechts één of twee eiwitten aanwezig zijn in een plek in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom 2D gel en biedt een kans om het identificeren van meerdere eiwitten in een 2D gel ter plaatse in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom en de dekking van de NFPA Proteoom te maximaliseren.
Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen van 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI-MS/MS en 2DE-LC-MS/MS die met succes zijn gebruikt bij de analyse van menselijke NFPA Proteoom. De protocollen zijn voorbereiding van monsters, eerst dimensie (elektrisch gericht, IEF), tweede dimensie (SDS-PAGE), visualisatie van eiwitten (Zilveren kleuring en Coomassie blue kleuring), beeld analyse van 2D gel, in-gel trypsine spijsvertering, zuivering van al peptiden, PMF, MS/MS en schroeiende3,8,25,26-database. Dit protocol vertaalt bovendien gemakkelijk voor de analyse van de proteomes van andere menselijke weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
2de, met inbegrip van de 2DE-MS PMF en 2DE-MS/MS, MS-methoden wordt gekoppeld is met succes gebruikt in onze lange termijn programma – het gebruik van proteomics menselijke NFPA proteomic variaties en moleculaire netwerk variaties voor de opheldering van het moleculaire mechanismen te bestuderen en ontdekking van effectieve biomarkers voor NFPAs. 2de gebaseerde vergelijkende proteomics met goede reproduceerbaarheid speelt een belangrijke rol bij de identificatie van de NFPA proteomic variaties9<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (Grant No. 81572278 en 81272798 naar XZ), de subsidies van China “863” Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot XZ), de Xiangya ziekenhuis fondsen voor Talent inleiding (tot XZ) en de Hunan Provinciale Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 aan XZ). De auteurs erkennen ook de wetenschappelijke bijdrage van Dr. Dominic M. Desiderio in de Universiteit van Tennessee Health Science Center. X.Z. voortdurend ontwikkeld en 2DE-MS-methoden gebruikt voor het analyseren van de hypofyse adenoom Proteoom vanaf 2001, bedacht het concept voor het huidige manuscript schreef en herziene versie van het manuscript, de relevante werkzaamheden gecoördineerd en was verantwoordelijk voor de financiële steun en bijbehorende werk. Y.L. nam deel aan de herziening van het manuscript. Y.H deelgenomen aan collectie verwijzingen naar, en herziening van het manuscript. Alle auteurs goedgekeurd het laatste manuscript.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
