2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합
Summary
여기, 우리는 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 분리 하 고 좋고 재현할 2DE 패턴 선물 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴 식별과 함께 제시. 많은 단백질은 고감도 석사의 사용과 복잡 한 암 프로테옴을 분석할 때 각 2DE 자리에 관찰 됩니다.
Abstract
인간의 뇌 adenoma (PA)는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하 고 임상 기능 또는 작동 하지 않는 PA (FPA 및 NFPA)으로 분류 될 수 있습니다 일반적인 종양 이다. NFPA 초기 단계 진단 및 치료 때문에 간신히 FPA에 비해 혈액에 호르몬을 높이기 어렵습니다. 우리의 장기 목표 PA 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 진단, 예 후 마커 및 치료 대상의 인식에 대 한 신뢰할 수 있는 biomarkers를 proteomics 메서드를 사용 하는 것입니다. 여기에 제시 된 효과적인 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 방법으로 결합 했다에서 젤 이미지 분석, 단백질 시각화, 2 차원 젤 전기 이동 법, 샘플의 준비를 포함 하 여 인간의 PA proteomes를 분석 하 트립 신 소화, 펩 티 드 대량 지문 (PMF), 및 탠덤 질량 분석 (MS/MS). 2 차원 젤 전기 이동 법 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS, 그리고 2DE-액체 크로마토그래피 (LC) MS/MS 절차 성공적으로 적용 된 NFPA 프로테옴의 분석에서. 높은 감도 질량 분석기를 사용 하 여, 많은 단백질 각 2D 젤 인간의 PA 프로테옴의 범위를 최대화 하기 위해 복잡 한 PA 조직 분석에 자리에서 2DE-LC-MS/MS 방법으로 확인 했다.
Introduction
PA 인간의 내 분 비 시스템에 중요 한 역할을 하는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하는 일반적인 종양 이다. PA 임상 기능 및 작동 하지 않는 파 (FPA 및 NFPA)1,2포함 되어 있습니다. NFPA 어렵습니다 초기 단계 진단 및 치료에 크게 혈액3,4 해당 호르몬의 수준을 증가 FPA에 비해 혈액에만 약간 상승된 호르몬 수준 (예를 들어, LH 및 FSH) 때문에 ,5. 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 바이오 마커의 발견 진단, 치료, 및 NFPA의 예 후에 중요 한 임상적 의미가 있다. 우리의 장기 목표는 개발 하 고 proteomic 메서드를 사용 하 여 그것의 분자 메커니즘을 명확 하 게 믿을 수 있는 바이오 마커의 발견을 위한 NFPA를 공부 하 고 효과적인 치료 대상 진단 및 예 후 마커 인식입니다. 2-데 MS 방법으로 결합 된 인간 PA 프로테옴1,2,6,7, 프로테옴 참조의 설립을 포함 하 여에 대 한 장기 연구 프로그램에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 3,8, 차동 표현한 단백질 프로필9,10,11,,1213, 호르몬 변종14의 분석 지도 ,15, 인 산화14 티로신 nitration16,,1718같은 포스트 번역 상 수정, 상대적으로 침략의 proteomic 변형 비 침범 성 NFPAs19, 그리고 NFPA 하위13, 여러 중요 한 통로 네트워크 (미토 콘 드 리아 기능 장애, 세포 주기 dysregulation, 산화 스트레스와 MAPK 신호의 발견에 지도 proteomic이 시스템 이상)는 NFPA13,,1920에 변경 될 수 있습니다.
2DE 분리 단백질 그들의 전자 점 (pI) (전자 포커스, IEF) 및 분자량 (나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법, SDS 페이지)를 통해1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 이것은 프로테옴 199524proteomics의 개념의 도입 이후, proteomics의 분야에서 일반적이 고 고전적인 분리 기술 이다. MS는 2DE 분리 단백질, PMF 및 MS/MS 전략 등의 정체성을 찾기 위한 중요 한 기술입니다. 검출 감도 및 해상도, 함께 LC 시스템의 개선의 측면에서 특히 MS 계기의 아주 급속 한 발전은 크게 향상 극대화 프로테옴에서 낮은 또는 매우 낮은 풍부한 단백질의 id는 프로테옴의 적용 범위입니다. 그것은 또한 유일한 한 우리의 전통적인 개념을 도전 또는 두 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 프로테옴의 분석에서 자리에 단백질과 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 분석에 자리에 있는 여러 단백질을 확인할 수 있는 기회를 제공 한다 프로테옴 NFPA 프로테옴의 범위를 극대화.
여기 우리 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS의 상세한 프로토콜 설명/MS, 그리고 2DE-LC-MS/MS 인간의 NFPA 프로테옴의 분석에서 성공적으로 사용 되었습니다. 프로토콜 포함 준비 샘플, 먼저 치수 (전자 포커스, IEF), 두 번째 차원 (SDS 페이지), 단백질 (실버 얼룩 및 Coomassie 파란 얼룩)의 시각화, 분석에서 젤 트립 신 소화, 2D 젤의 이미지 tryptic 펩 티 드, PMF, MS/MS, 및3,8,,2526타는 듯한 데이터베이스의 정화. 또한,이 프로토콜은 쉽게 다른 인체 조직 proteomes의 분석에 대 한 변환합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 장기 프로그램-인간의 NFPA proteomic 변화와 분자 메커니즘의 해명에 대 한 분자 네트워크 변화를 연구 하는 proteomics의 사용에에서 2DE, 2DE MS PMF 등 2DE-MS/MS, MS 방법을 함께 성공적으로 사용 하 고 NFPAs에 대 한 효과적인 바이오 마커의 발견입니다. 좋은 재현성 2DE 기반 비교 proteomics NFPA proteomic 유사9,10,,11<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 (보조금 번호 81572278 및 81272798 XZ), 중국 “863” 계획 프로젝트 (XZ 부여 제 2014AA020610-1), 재능에 대 소개 (XZ) Xiangya 병원 기금과는 호남에서 보조금의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다 중국의 지방 자연 과학 재단 (XZ에 보조금 번호 14JJ7008). 저자는 또한 테네시 대학 건강 과학 센터에서 박사 도미 닉 M. Desiderio의 과학적 기여를 인정합니다. X.Z. 지속적으로 개발 2001 년부터 시작 하는 뇌 하 수 체 adenoma 프로테옴 분석 2DE MS 방법을 사용, 현재 원고에 대 한 개념을 잉태, 쓴 원고를 수정, 조정 관련 업무, 그리고에 대 한 책임은 금융 지원 및 해당 작업입니다. Y.L. 원고 개정에 참가 했다. Y.H 참조, 컬렉션 및 원고 개정에 참가 했다. 모든 저자는 최종 원고를 승인 했다.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
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