İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez
Summary
Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.
Abstract
İnsan hipofiz adenom (PA) insan hipofiz bezi hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sisteminde oluşur ve klinik olarak işlev veya işlevsiz PA (odak ve NFPA) sınıflandırılabilir ortak bir tümördür. NFPA erken aşamada tanı ve tedavi ancak odak için karşılaştırıldığında kan hormon yükselen nedeniyle zordur. Uzun vadeli hedefimiz güvenilir biyolojik açıklama PA moleküler mekanizmaları ve etkili tanı, prognostik işaretleri ve tedavi hedefleri tanınması için keşfetmek için proteomik yöntemleri kullanmaktır. Kütle spektrometresi (MS) yöntemlerle birleştiğinde etkili iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) buraya örnekleri, 2D Jel Elektroforez, protein görselleştirme, görüntü analizi, jel hazırlanması da dahil olmak üzere insan PA proteomes analiz sunuldu Tripsin sindirim, peptid kitle parmak izi (PMF) ve tandem spektrometresi (MS/MS) kitle. 2-boyutlu Jel Elektroforez matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi PMF (2DE-maldı MS PMF), 2DE-maldı MS/MS ve 2DE-sıvı Kromatografi (LC) MS/MS yordamları başarıyla uygulanan NFPA Proteom analizinde bir. Bir yüksek-duyarlı Kütle Spektrometre kullanımıyla, birçok protein ile her 2D jel insan PA Proteom kapsamını maksimize etmek için karmaşık PA doku analizinde bir spot 2DE-LC-MS/MS yönteminde tespit edilmiştir.
Introduction
PA insan endokrin sisteminde önemli roller oynar hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sistemleri insan hipofiz bezinde oluşan ortak bir tümördür. PA klinik olarak fonksiyonel ve işlevsiz PAs (odak ve NFPA)1,2içerir. NFPA erken aşamada tanı ve tedavisi nedeniyle sadece biraz yüksek hormon düzeyleri (örneğin, LH ve FSH) kan kan3,4 karşılık gelen hormon düzeyleri önemli ölçüde artmıştır odak göre zordur ,5. Moleküler mekanizmalar açıklama ve etkili biyolojik keşfi tanı, tedavi ve NFPA Prognozunda önemli klinik öneme sahip. Uzun vadeli hedefimiz geliştirmek ve NFPA onun moleküler mekanizmaları netleştirmek için güvenilir biyolojik keşfi için çalışmaya proteomik yöntemleri kullanın ve tanılama ve prognostik işaretleri yanı sıra etkili tedavi hedefleri tanımak olduğunu. 2-DE MS yöntemleri ile birleştiğinde kapsamlı bir şekilde kullanıldığını Proteom başvuru kurulması da dahil olmak üzere insan PA Proteom1,2,6,7, ilgili uzun vadeli araştırma programımızda 3,8, analiz differentially ifade protein profilleri9,10,11,12,13, hormon türevleri14 haritalar ,15, fosforilasyon14 ve tirozin nitration16,17,18gibi translasyonel modifikasyon, göreli olarak invazif proteomik varyasyonu invaziv olmayan NFPAs19ve birden çok önemli yolu (mitokondrial disfonksiyon, hücre döngüsü bozukluk, oksidatif stres ve ağları MAPK sinyal keşfi yol açan NFPA alt türlerinden13, proteomik heterojen Sistem anormallik) NFPA13,19,20dakikaya değişmiş.
2DE ayıran proteinler isoelectric noktası (PI) (isoelectric odaklanarak, IEF) ve molekül ağırlığı (yolu ile Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez, SDS-sayfa) göre1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. bu ortak ve klasik ayırma proteomik, alanında Proteom ve proteomik içinde 199524kavramlarını giriş beri bir tekniktir. MS 2DE ayrılmış proteinlerin PMF ve MS/MS stratejileri de dahil olmak üzere kimlik bulmak için çok önemli bir tekniktir. MS aletleri, özellikle de algılama hassasiyeti ve çözünürlük, LC sistemi, geliştirilmesi ile birlikte yönleri çok hızlı gelişimi büyük ölçüde düşük veya çok düşük bereket proteinler arasında en üst düzeye çıkarmak için bir Proteom kimlik geliştirir bir Proteom kapsama. Bu da bizim geleneksel kavramları yalnızca bir meydan okuyor veya iki protein 2B jel karmaşık insan dokusu Proteom analizinde bir nokta mevcut ve birden çok protein 2B jel karmaşık insan dokusu analizinde bir nokta belirlemek için bir fırsat sağlar Proteom ve NFPA Proteom kapsama en üst düzeye çıkarmak.
Burada 2DE-maldı MS PMF, 2DE-maldı MS detaylı protokolleri açıklamak/MS ve 2DE-LC-MS/başarıyla insan NFPA Proteom analizinde kullanılan MS. İletişim kuralları hazırlık içerir örnekleri, ilk ikinci boyut (isoelectric odaklanarak, IEF), (SDS-sayfa), görselleştirme (Gümüş boyama ve Coomassie mavi boyama) proteinlerin boyut, görüntü analiz 2D jel, jel tripsin sindirim, Arıtma tryptic peptidler, PMF, MS/MS ve3,8,25,26yakıcı veritabanı. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer insan dokusu proteomes analiz için çevirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE 2DE-MS PMF ve 2DE-MS/MS, MS yöntemleri ile birleştiğinde, başarılı bir şekilde kullanılmıştır bizim uzun vadeli programı – insan NFPA proteomik varyasyonları ve moleküler ağ çeşitleri için moleküler mekanizmaları aydınlatma çalışmaya proteomik kullanımı ve NFPAs için etkili biyolojik keşfi. İyi tekrarlanabilirlik ile karşılaştırmalı proteomik 2DE tabanlı NFPA proteomik varyasyonları9,10,11…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Çin (Grant Hayır 81572278 ve 81272798 olarak XZ), Çin “863” planı Projesi (Grant No XZ için 2014AA020610-1), Hunan ve yetenek Giriº (XZ) Xiangya hastane fon gelen hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Çin’in il doğal Bilim Vakfı (XZ için Grant No. 14JJ7008). Yazarlar da Dr Dominic M. Desiderio Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi içinde bilimsel katkısını kabul. X.Z. sürekli olarak geliştirilen ve 2DE-MS yöntemleri 2001’den başlayarak hipofiz adenom Proteom çözümlemek için kullanılan, mevcut el yazması için kavram gebe, yazdı ve el yazması revize, ilgili çalışmaları koordine ve sorumlu mali desteği ve karşılık gelen çalışma. Yl el yazması revizyonunda katıldı. Y.H başvurular topluluğu ve el yazması revizyonu’na katılmıştır. Tüm yazarlar son el yazması onayladı.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
