Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in besmette waterige rode bloedcellen, met behulp van een verzwakte totale reflectie infrared spectrometer en multivariate data-analyse.
Abstract
We tonen een methode voor de kwantificering en opsporing van parasieten in waterige rode bloedcellen (RBC) met behulp van een eenvoudige benchtop verzwakt totale reflectie Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in combinatie met Multivariate Data-analyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum werden gekweekt voor 10% parasitemia ring fase parasieten en gewend spike verse donor geïsoleerd RBC een verdunning als reeks wilt maken tussen 0 – 1%. 10 µL van elk monster werden geplaatst in het midden van het venster van de diamant ATR te verwerven van het spectrum. De sample data werd behandeld om de signaal / ruisverhouding en te verwijderen van de bijdrage van water, en vervolgens de tweede afgeleide werd toegepast om op te lossen van de spectrale eigenschappen. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met behulp van twee soorten MVDA: eerste belangrijkste componenten analyse (PCA) om uitschieters waarna gedeeltelijke regressie met kleinste kwadraten (PLS-R) om te bouwen van het model van de kwantificering.
Introduction
Malaria is een van de meest verwoestende ziekten van onze tijd; meer dan de helft van de bevolking woont in endemische gebieden in gevaar en het onevenredig jaagt de slechte1,2,3,4. Een groot deel van het probleem is de asymptomatische dragers en vroege fase patiënten die fungeren als reservoirs voor mosquito vectoren5, waardoor pieken van infectie tijdens natte seizoenen en toestaand het om te volharden in gemeenschappen. Malaria wordt veroorzaakt door vijf Plasmodium parasieten, de meest dodelijke daarvan is P. falciparum , waardoor de meest ernstige vorm van de ziekte-2.
Technieken voor de diagnose van malaria zijn op dit moment minder dan perfect. Optische microscopie, de huidige gouden standaard, kan alleen detecteren 62-88 parasieten/µL afhankelijk van de gebruikte methode6. Bovendien, als gevolg van de intensiteit en de hoge vaardigheid vereist, in vele regio’s microscopie misdiagnoses > 50% van de gevallen, vooral die met lage parasitemie niveaus2, die rechtstreeks kan worden toegeschreven aan het gebrek aan hulpbronnen in het gebied en de resultaten in het misbruik van anti-malaria drugs. De andere 2 belangrijkste diagnostische methoden zijn snelle Diagnostische Tests (RDTs), die gebruik maken van antilichamen voor de detectie, en Polymerase Chain Reaction (PCR) tests, die discrimineren en kwantificeren van parasieten uit DNA. Momenteel zijn RDTs uitsluitend kundig voor speurder P. falciparum en P. vivax van ten minste 100 parasieten/µL bloed wat resulteert in zeldzamere vormen van de ziekte worden onbehandeld. 7 , 8 daarentegen PCR testen discrimineren en kwantificeren van de verschillende soorten Plasmodium bij een gevoeligheid van 0.0004-5 parasieten/µL bloed. Echter, het dure reagentia, apparatuur en technische vaardigheid vereist, en is dus niet geschikt voor de toepassing van het veld.
Een zeer gevoelige, betrouwbare en betaalbare techniek is essentieel voor het verbeteren van de diagnose tijden, en dus betere geduldige resultaten en ziekteverwijdering mogelijk te maken. Verzwakte totale reflectie Fourier transformatie (ATR-FTIR) spectroscopie biedt een mogelijke oplossing voor dit probleem. Vorige werk heeft aangetoond dat het mogelijk was om detecteren en kwantificeren van P. falciparum in methanol vaste bloedfilms bereiken de detectiegrenzen van < 1 parasiet/µL bloed (< 0.0002% parasitemia)9, die vergelijkbaar met PCR methodes is. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is te detecteren en kwantificeren van parasieten in waterige monsters en dus het elimineren van de fixatie stap. Factoren zoals waterdamp, spectrale lawaai en gegevens behandeling moeten echter worden in aanmerking genomen voor optimale resultaten10.
Dit protocol heeft tot doel nieuwe gebruikers leert verwerven ATR-FTIR spectra en een regressiemodel voorbereiden met de opsporing van P. falciparum van waterige rode bloedcellen (RBC) monsters10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R-model is een gecontroleerde multivariate methode waarmee wordt gezocht naar een lineaire relatie, Y = bX + E, tussen de voorspellende variabelen X (hier, de absorptie bij elke golfgetal) en een continu variabele Y (hier, het niveau van de parasitemia). Kortom, het model combineert de variabelen in X bij het maken van een nieuwe reeks van latente variabelen (LVs) die de variantie in X gecorreleerd met Y vangen, en berekent de vector van een regressie (b) een nieuwe resultaten van het spectrum in de schatting van de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aan de auteurs financiering werd verstrekt door de Australian Research Council (toekomst Fellowship FT120100926 aan BRW), nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië (Program grant en Senior Research Fellowship aan JGB; Vroege carrière Fellowships JSR; Infrastructuur voor onderzoek instituten ondersteuning regeling subsidie aan het Instituut Burnet), en de Victoriaanse staat regering operationele infrastructuur ondersteuning subsidie aan het Instituut Burnet. Wij erkennen Mr. Finlay Shanks voor instrumentele ondersteuning.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
