Выявление и количественная оценка Plasmodium falciparum в водный красных кровяных клеток, ослабленных общее отражение инфракрасной спектроскопии и многомерного анализа данных
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для выявления и количественной оценки Plasmodium falciparum в зараженных водный красных кровяных клеток, используя аттенуированные полного отражения инфракрасного спектрометра и анализа многомерных данных.
Abstract
Мы демонстрируем метод количественной оценки и выявления паразитов в водный красных кровяных телец (эритроцитов), используя простой benchtop ослабленных общее отражение Фурье преобразование инфракрасного (ATR-FTIR) спектрометра в сочетании с (многомерный анализ данных MVDA). 3D 7 P. falciparum были культивировали 10% паразитемии кольцо стадии паразитов и используется для всплеска эритроциты свежие доноров изолированы для создания разрежения серии между 0-1%. 10 мкл каждого образца были помещены на центр ATR алмазов окна для получения спектра. Образец данных лечился улучшить соотношение сигнал-шум и для удаления воды, и затем вторая производная был применен для решения спектральной функции. Данные затем были проанализированы с использованием двух типов MVDA: первый анализ главных компонент (PCA) чтобы определить любые промахи и затем частичной регрессии методом наименьших квадратов (PLS-R) построить модель количественной оценки.
Introduction
Малярия является одним самых разрушительных болезней нашего времени; более половины населения живет на риск в эндемичных регионах и он непропорционально бремя бедных1,2,3,4. Большая часть этого вопроса является бессимптомных носителей и ранней стадии пациентов, которые выступают в качестве резервуаров для комаров векторов5, вызывая пики инфекции во влажных сезонов и позволяет ему сохранять в общинах. Малярия вызывается пять Plasmodium паразитов, наиболее смертоносной из которых является P. falciparum , который приводит к наиболее тяжелая форма болезни2.
В настоящее время методов для диагностики малярии менее совершенны. Оптическая микроскопия, текущего золотого стандарта, может определять только 62-88 паразитов/мкл в зависимости от используемого метода6. Кроме того, из-за интенсивность и высокие навыки, необходимые, в многих регионах микроскопия misdiagnoses > 50% случаев, особенно с низкой паразитемии уровней2, которые можно непосредственно отнести отсутствие ресурсов в этом районе и результаты в злоупотребление противомалярийных препаратов. Другие 2 основные диагностические методы являются диагностические экспресс-тесты (БДТ), которые используют антитела для обнаружения и анализы полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые являются дискриминационными и количественно паразитов из ДНК. В настоящее время БДТ только способны обнаруживать P. falciparum и P. vivax по крайней мере 100 паразитов/мкл крови, что приводит к редких форм этого заболевания лечить. 7 , 8 в отличие от этого, анализы ПЦР дискриминацию и количественно разных видов плазмодия чувствительность 0.0004-5 паразитов/мкл крови. Однако он требует дорогостоящих реагентов, оборудования и технических навыков и таким образом не подходит для области применения.
Очень чувствительной, надежной и доступной техника имеет важное значение для улучшения диагностики раз и таким образом улучшение результатов лечения пациентов и возможность ликвидации болезни. Ослабленная общее отражение Фурье-спектроскопии преобразования (ATR-FTIR) предлагает потенциальным решением этой проблемы. Предыдущие работы показал, что возможности для выявления и количественной оценки P. falciparum в метаноле фиксированной мазков крови, достижение пределов обнаружения из < 1 паразитов/мкл крови (< 0,0002% паразитемии)9, которая сопоставима с методами ПЦР. Недавние исследования показали, что это возможно для выявления и количественной оценки паразитов водных проб и таким образом устранить на этапе фиксации. Однако такие факторы, как водяной пар, спектральные шума и обработки данных необходимо принимать во внимание для достижения оптимальных результатов10.
Этот протокол имеет целью показать новых пользователей как приобрести ATR-FTIR спектры и подготовить модель регрессии для обнаружения P. falciparum от водных проб эритроцитов (РБК)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R модель находится под наблюдением многомерный метод, который находит линейную связь, Y = bX + E, между прогнозирования переменными X (здесь, поглощения на каждом волновое) и непрерывной переменной Y (здесь, на уровень паразитемии). Короче говоря, модель сочетает в себе переменные в X, чтобы ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование авторам было предоставлено Австралийский исследовательский совет (стипендий FT120100926 будущее в BRW), национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (Грант программы и старший стипендий для ИГБ; Начале карьеры стипендии JSR; Инфраструктуры для научно-исследовательских институтов поддержки схемы Грант института Burnet), и оперативной инфраструктуры правительство викторианской государственной поддержки Грант института Burnet. Мы признаем, что г-н Финлей хвостовик для инструментальной поддержки.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
