זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum מימית אדום דם תאים נגועים באמצעות ספקטרומטר אינפרא-אדום השתקפות הכולל הקלוש של ניתוח נתונים רב משתנית.
Abstract
נדגים שיטה של כימות וזיהוי של טפילים של כדוריות דם אדומות מימית (RBCs) באמצעות benchtop פשוטה של ספקטרומטר הקלוש הכולל השתקפות פורייה להפוך אינפרא-אדום (ATR-FTIR) בשילוב עם ניתוח נתונים Multivariate ( MVDA). 3D 7 falciparum פ היו בתרבית כדי 10% parasitemia הטבעת הבמה טפילים, נהגה ספייק RBCs התורם טריים מבודד כדי ליצור לדילול סדרת בין 0-1%. 10 µL של כל מדגם הוצבו במרכז החלון יהלום ATR לרכוש את הספקטרום. הנתונים לדוגמה התייחסו כדי לשפר את האות לרעש יחס, כדי להסיר את התרומה של מים, אז הנגזרת השנייה הוחל לפתרון תכונות ספקטרליות. הנתונים נותחו לאחר מכן באמצעות שני סוגים של MVDA: הראשון העיקרי רכיב ניתוח (PCA) כדי לקבוע כל ליניאריים ולאחר מכן הריבועים הפחותים חלקית רגרסיה (PLS-R) כדי לבנות את הדגם כמת.
Introduction
מלריה היא בין המחלות ההרסניות ביותר של זמננו; ממחצית האוכלוסייה בסיכון באזורים אנדמיים וחיים זה פרופורציה מוטלת המסכן1,2,3,4. חלק גדול של הנושא הוא נשאים ללא תסמינים בתחילת שלב חולים לשמש מאגרים עבור יתושים וקטורים5, גורם קוצים של זיהום בעונות רטובות ומאפשר שזה נמשכות בקהילות. מלריה נגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום חמש, הקטלני ביותר מהם הוא falciparum פ הגורמת הצורה החמורה ביותר של המחלה2.
נכון לעכשיו, טכניקות לאבחון של מלריה הם פחות ממושלם. מיקרוסקופ אופטי, תקן הזהב הנוכחי, יכול לזהות רק 62-88 טפילים/µL בהתאם שיטת6. יתר על כן, עקב intensiveness מיומנות גבוהה הנדרשים, המוצאות מיקרוסקופ אזורים רבים > 50% מהמקרים, במיוחד אלה עם parasitaemia נמוך רמות2, אשר ניתן ישירות לייחס חוסר משאבים באזור ותוצאות ניצול לרעה של תרופות נגד מלריה. 2 ראשי אבחון לשיטות אחרות הן בדיקות אבחון מהיר (RDTs), אשר מנצלים נוגדנים עבור זיהוי וכן מבחני פולימראז תגובת שרשרת (PCR), אשר מפלים ולכמת טפילים מ- DNA. כיום, RDTs הם רק מסוגלים לזהות falciparum פ ו פ vivax לפחות 100 טפילים µL הדם וכתוצאה מכך צורות נדירות יותר של המחלה להיות מטופל. 7 , 8 לעומת זאת, מבחני ה-PCR להפלות ולכמת מינים שונים של הפלזמודיום -רגישות של 0.0004-5 טפילים/µL של דם. עם זאת, שזה דורש ריאגנטים יקר, ציוד, מיומנות טכנית, ולכן אינה מתאימה עבור היישום בשדה.
טכניקה מאוד רגיש, אמין ובמחיר חיוני כדי לשפר את האבחון פעמים, ובכך שיפור תוצאות המטופל ואני עושה מחלות חיסול אפשרי. הקלוש הכולל השתקפות (ATR-FTIR) ספקטרוסקופיית פורייה מציעה פתרון אפשרי לבעיה זו. עבודה קודמים הראו כי ניתן היה לזהות ולכמת falciparum פ ב מתנול קבוע סרטים דם בהשגת זיהוי גבולות < טפיל 1/µL של דם (< 0.0002% parasitemia)9, אשר דומה לדקל שיטות PCR. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שניתן לזהות, לכמת טפילים בדגימות מימית ולהסיר ובכך לשלב קיבוע. עם זאת, גורמים כמו אדי מים, רעש ספקטרלי וטיפול נתונים צריך להילקח בחשבון לקבלת תוצאות אופטימליות10.
פרוטוקול זה נועד להראות משתמשים חדשים כיצד לרכוש ATR-FTIR ספקטרה ולהכין מודל רגרסיה איתור falciparum פ מ דגימות מימית של תאי דם אדומים (RBC)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל PLS-R היא שיטה רב משתנית תחת פיקוח המוצאת הקשר הליניארי, Y = bX + E, בין המשתנים חזוי X (כאן, את ספיגת-כל מספר גל) ו- Y משתנה רציף (כאן, רמת parasitemia). בקיצור, המודל משלב את המשתנים ב- X כדי ליצור קבוצה חדשה של המשתנים החבויים (אותו) כי ללכוד את השונות ב- X בקורלציה עם Y, ולאחר מחשבת את וקטור רגרסיה (b) זה מו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון ליוצרים סופק על ידי המועצה מחקר אוסטרלי (העתיד מלגת FT120100926 כדי BRW), הלאומי לבריאות, רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה (תוכנית גרנט, בכיר מחקר לאגודה כדי JGB; הקריירה המוקדמת מלגות JSR; תשתית למחקר מוסדות תמיכה גרנט ערכת למכון ברנט), התשתית המבצעית של הממשלה ויקטוריאני המדינה לתמוך גרנט למכון ברנט. אנו להכיר מר פינלי שאנקס לקבלת תמיכה אינסטרומנטלית.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
