Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.
Abstract
Dimostriamo un metodo di quantificazione e individuazione di parassiti in acquosa di globuli rossi (RBCs) utilizzando un semplice benchtop attenuato totale riflessione Fourier Transform spettrometro a infrarossi (ATR-FTIR) in combinazione con l’analisi multivariata dei dati ( MVDA). 3 7 p. falciparum sono stati coltivati a parassiti fase 10% parassitemia anello e utilizzato a picco i globuli rossi del donatore fresco isolato per creare una diluizione serie tra 0 – 1%. 10 µ l di ciascun campione sono stati collocati al centro della finestra di diamante ATR per acquisire lo spettro. I dati di esempio è stati trattati per migliorare il rapporto segnale-rumore e rimuovere il contributo di acqua, e quindi la derivata seconda è stata applicata per risolvere caratteristiche spettrali. I dati sono stati quindi analizzati utilizzando due tipi di MVDA: primo Principal Component Analysis (PCA) per determinare eventuali valori anomali e quindi regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R) per compilare il modello di quantificazione.
Introduction
La malaria è tra le più devastanti malattie del nostro tempo; oltre la metà della popolazione vive a rischio nelle regioni endemiche ed esso sproporzionatamente opprime il povero1,2,3,4. Gran parte del problema è i portatori asintomatici e primi pazienti di stadio che fungono da serbatoi per zanzare vettori5, causando picchi di infezione durante stagioni umide e permettendogli di persistere nelle comunità. La malaria è causata da parassiti Plasmodium cinque, il più mortale di cui è p. falciparum che causa la forma più grave della malattia2.
Attualmente, le tecniche per la diagnosi di malaria sono meno che perfetto. Microscopia ottica, il gold standard attuale, è in grado di rilevare solo 62-88 parassiti / µ l a seconda del metodo utilizzato6. Inoltre, a causa della intensità e alta abilità richiesto, in molte regioni microscopia mal diagnostica > 50% dei casi, soprattutto quelli con bassa parassitemia livelli2, che possono essere direttamente attribuiti alla mancanza di risorse nella zona e risultati in l’uso improprio di farmaci anti-malarici. Gli altri 2 metodi diagnostici principali sono test diagnostici rapidi (RDT), che utilizzano gli anticorpi per la rilevazione e l’analisi di reazione a catena della polimerasi (PCR), che discriminano e quantificare i parassiti dal DNA. Attualmente, RDTs sono solo in grado di rilevare p. falciparum e p. vivax di almeno 100 parassiti / µ l di sangue con conseguente forme più rare della malattia non viene trattata. 7 , 8 al contrario, analisi di PCR discriminare e quantificare le diverse specie di Plasmodium ad una sensibilità di 0,0004-5 parassiti / µ l di sangue. Tuttavia, esso richiede costosi reagenti, equipaggiamento e abilità tecnica e pertanto non è adatto per l’applicazione del campo.
Una tecnica altamente sensibile, affidabile e conveniente è essenziale per migliorare i tempi di diagnosi e così migliorando i risultati pazienti e rendendo possibile l’eliminazione della malattia. Attenuato totale riflessione spettroscopia trasformata di Fourier (ATR-FTIR) offre una possibile soluzione a questo problema. Il lavoro precedente ha indicato che era possibile rilevare e quantificare da p. falciparum in metanolo fissata pellicole di anima raggiungendo i limiti di rilevazione di < 1 parassita / µ l di sangue (< 0,0002% parassitemia)9, che è paragonabile ai metodi PCR. Studi recenti hanno dimostrato che è possibile rilevare e quantificare i parassiti in campioni acquosi e quindi eliminare il punto di fissazione. Tuttavia, fattori come il vapore acqueo, rumore spettrale e trattamento dei dati devono essere presi in considerazione per un risultato ottimale10.
Questo protocollo si propone di mostrare nuovi utenti come acquisire spettri ATR-FTIR e preparare un modello di regressione per il rilevamento di p. falciparum da acquose di campioni di globuli rossi (RBC)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modello: PLS-R è un metodo multivariato supervisione che trova una relazione lineare, Y = bX + E, tra le variabili predittive X (qui, l’assorbanza a ciascun numero d’onda) e un continuo variabile Y (qui, il livello di parassitemia). In breve, il modello combina le variabili in X per creare un nuovo insieme di variabili latenti (LVs) che catturano la varianza su X correlato con Y e calcola un vettore di regressione (b) che moltiplicato per un nuovo risultati di spettro nella stima del valore y. La forza del modello può …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamenti agli autori è stato fornito dall’Australian Research Council (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (programma grant e Senior Research Fellowship di JGB; Inizio carriera Fellowships JSR; Infrastruttura per la ricerca istituti Grant Scheme supporto all’Istituto Burnet), e supporta l’infrastruttura operativa del governo di Victorian State Grant all’Istituto di Burnet. Riconosciamo il signor Finlay Shanks per sostegno strumentale.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
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