Summary
Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.
Abstract
Transplante de rim é agora uma terapia convencional para o estágio final da doença renal. No entanto, com cerca de 96.000 pessoas na lista de espera e apenas um quarto desses pacientes realizar o transplante, há uma grande necessidade de alternativas para aqueles com falência de órgãos. A fim de diminuir as consequências prejudiciais da diálise juntamente com os custos globais de saúde incorre, investigação está em curso em busca de soluções alternativas para a transplantação de órgãos. Implantáveis engenharia de tecido renais celulares construções são uma tal abordagem viável para substituir a funcionalidade renal perdida. Aqui, descrita pela primeira vez, é o microdissection dos rins murino para isolamento de vida córtico segmentos renais. Esses segmentos são capazes de rápida incorporação dentro de construções de andaime-free endotelial-fibroblasto que lhe permitam conexão rápida com a vasculatura hospedeiro uma vez implantada. Os rins do rato adulto foram colhidos em dadores vivos, seguidos pelo estereoscópio microdissection obter segmentos renais 200-300 µm de diâmetro. Várias construções renais foram fabricadas usando segmentos renais primários, colhidos a partir de apenas um rim. Este método demonstra um procedimento que poderia salvar o tecido renal funcional de órgãos que seria caso contrário serão descartados.
Introduction
Doença renal crônica (DRC) é um do atual saúde pública desafios em todo o mundo1. A prevalência de DRC nos Estados Unidos é mais 14% do total da população, com mais de 600.000 americanos sofrem de forma mais severa, estágio final da doença renal (DRT)2. As atuais opções de tratamento disponíveis para aqueles com DRT incluem transplante renal e diálise. Apesar de aproximadamente 25.000 pacientes submetidos a transplante renal a cada ano, um número significativo de pacientes é adicionado anualmente levando a uma grande disparidade entre aqueles que aguardam um órgão de salvamento e aqueles recebendo transplante3. Além de seus graves efeitos negativos na qualidade de vida e longevidade, diálise está associado um encargo financeiro surpreendente. Em 2014, o Medicare paga reivindicações mais totalizou US $ 30 bilhões para DRT pacientes2. Com um suprimento limitado de órgão e sem aparente tendência de baixa em pacientes que necessitam de diálise, os esforços de investigação visam identificar soluções alternativas para diálise e transplante são sempre importantes. Mesmo um atraso relativamente curto na necessidade de diálise aumenta o número de um paciente dos anos de vida ajustados por qualidade e produtividade substancialmente enquanto adiar custos relacionados com a diálise4,5,6.
Soluções para a perda de tecido funcional, assim na DRT, atualmente estão sendo estudadas na engenharia de tecidos e medicina regenerativa laboratórios, com abordagens amplamente variadas, variando de fabricação baseados em andaime organoides para órgão inteiro usando engenharia decellularized estruturas de órgão para implantação celular7,8,9,10,11. Recapitulando complexas estruturas renais de rins marginais ou descartados foi parcialmente investigado. Na verdade, quase 20% dos rins para transplante são descartados por várias razões12,13. O tecido renal funcional destes enxertos putativos poderia ser utilizado e incorporado uma ou muitas construções de engenharia de tecidos. Estudos prévios têm demonstrado a viabilidade de trabalhar com estes órgãos descartados, utilizando os rins para a matriz extra-celular para engenharia de tecido fins14,15. No entanto, poucos têm usado tecido nephronal primário de rins saudáveis para fins de engenharia de tecidos a16,17,18.
Um método anteriormente descrito por Kim et al envolve isolamento de renais "segmentos" de rins de rato saudável, que em seguida foram semeados em andaimes de (PGA) ácidos poliglicólico para fabricação de construção16. No entanto, pouca informação é dada em relação a metodologia exata de dissecação, e segmentos foram obtidos a partir de uma combinação de picagem fina e filtração. Nós descrevemos uma modificação do presente protocolo, que da mesma forma, produz discretos segmentos renais com arquitetura nephronal intacto, mas em vez disso se baseia em técnicas de microdissection. Nephrectomies são executadas em ratos adultos vivos, depois que os rins são transferidos para o microscópio de dissecação onde é removida a cápsula renal, e o tecido é mais dissecado. Pequeno calibre agulhas 30½ G são usadas como instrumentos de corte e também como guias, ajudando na dissecação, como a agulha de diâmetro é igual ao diâmetro do alvo dos segmentos renais. Os segmentos isolados, neste caso murino, renais mantêm viabilidade em cultura e incorporam com construções celular livre de andaime endotelial-fibroblasto19. Essas construções têm sido utilizadas anteriormente para engenheiro de outros órgãos, incluindo pâncreas artificial bio20.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos animais descritos abaixo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) na Medical University of South Carolina, antes de qualquer animais cirurgias ou uso de quaisquer tecidos animais.
1. murino nefrectomia
- Não uma máscara cirúrgica e tampão bouffant para minimizar o risco de contaminação. Manter a esterilidade durante a configuração da área cirúrgica.
- Coloque cortinas cirúrgicas não-fenestrado na mesa de operação.
- Abre a mochila de instrumentos esterilizados para as cortinas estéril. Os instrumentos necessários para nefrectomia incluem 3 hemostatos pequenos, finas pinças com dentes, pinça fina sem dentes e a tesoura de íris reta.
- Coloque outro não fenestrado cirúrgica drapeja no centro da mesa de operações.
- Prepare-se 5 mL de Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS) com cálcio e magnésio, suplementado com 1% penicilina/estreptomicina em um tubo cônico estéril 15 mL. Coloque esta solução no gelo ao lado da mesa de operações.
- Obter um rato C57BL/6 de 8-12 semanas (masculino ou feminino) em relação ao complexo de alojamento dos animais.
- Posicione o mouse dentro de uma câmara de indução da anestesia e induzir com isoflurano 3,5% inalado. Coloque um cone de nariz do mouse, usando 2% de isoflurano para a anestesia de manutenção.
- Monitor para adequada profundidade de anestesia periodicamente durante todo o procedimento cirúrgico avaliando para pedal reflex (pitada de dedo firme).
- Remova todo o cabelo do tronco ventral usando o creme depilatório. Enxague a área com água destilada para garantir que todo o cabelo foi removido do abdômen.
- Transferi o mouse para a mesa de operações estéril em posição supina sob a cortina não fenestrado superior. Corte uma fenestração de2 2 x 2 cm na cortina sobrejacente apenas o abdômen do mouse.
- Aplica iodo-povidona, seguido por 70% de etanol para o abdômen, usando bolas de algodão ou gaze estéril.
- Usando a pinça fina com dentes e iris tesouras, faça uma incisão de pele abdominal vertical de 3-4 cm paralelo à linha média, 0,5 cm para a esquerda da linha média
Nota: Se tentar remover o rim direito, esta será uma incisão de 0,5 cm à direita da linha média.- Segure o peritônio com pinça fina, sem dentes e cortar com uma tesoura de íris para entrar na cavidade abdominal. Aplica hemostatos as bordas laterais superiores e inferiores, pele e peritônio colocar tensão lateralmente e aumentar a exposição.
- Deslocar o conteúdo intestinal delicadamente para o lado direito do abdômen para expor o rim esquerdo. Coloque delicadamente a tração no rim para elevá-lo fora do abdômen.
- Coloque uma pinça hemostática através do hilo do rim esquerdo. Use tesoura de íris para transecto o ureter e vasos renais.
- Coloque o rim esquerdo no 1% solução de DPBS penicilina/estreptomicina no gelo.
- Transferi o tubo contendo o rim para o bairro de cultura de tecido estéril. Transferi o rim do tubo cônico de 15 mL para um prato de petri de 60-mm (Figura 1). Lave duas vezes com 5 mL DPBS com cálcio e magnésio. Manter o rim suspendido em 5 mL DPBS no prato 60mm.
- Prepare um prato de petri 60mm adicionais com 5 mL DPBS deve ser usado durante o protocolo de microdissection.
- Eutanásia o mouse por toracotomia e perda de sangue após a aquisição do rim, de acordo com um protocolo de animais IACUC aprovado.
2. murino rim Microdissection para isolamento de segmento Renal
- Continue usando uma técnica estéril para esta parte do protocolo, incluindo luvas estéreis, máscara cirúrgica e shampoo para minimizar o risco de contaminação.
- Lugar estéril cortinas na plataforma de microscópio estéreo também quanto à áreas saiu e direito do microscópio de ter um campo estéril para instrumentos. Coloque folhas de adesivo plástico sobre os botões de foco do microscópio e pulverizar com etanol a 70%. Liga o iluminador de pescoço de cisne dual para iluminar o palco.
- Aberto instrumentos esterilizados (pinça fina sem dentes, alça para bisturi, lâmina de bisturi #15, duas retos hemostatos, duas 30½ calibre agulhas de calibre oco) para cortinas estéril. Lâmina de lugar o #15 no bisturi tratar agora e anexar uma pinça hemostática para cada adaptador de agulha/hub para criar instrumentos de dissecção de agulha para uso posterior, conforme mostrado na Figura 1.
- Mova os pratos de petri-60mm, um contendo o rim em DPBS e outros DPBS a única, do bairro cultura de tecidos para a área de microscópio.
- Coloque o prato de petri 60mm no âmbito do objectivo e retire a tampa para expor o rim. Deixe o prato contendo DPBS ao lado no campo estéril para uso posterior.
- Mova o prato para que apenas a superfície anterior ou posterior do rim está em exibição (ou seja, a grande cara lisa do rim, com a outra face, tocar no fundo do prato). Aumentar o zoom 3.2-4x para esta parte do procedimento. Usando a mão não dominante, use pinça fina, sem dentes para perfurar e fixar o rim contra o prato perto dos polos superiores e inferiores do rim.
- Mantenha a mão não dominante no lugar para fixar o rim. Com a mão dominante, utilize a lâmina #15 para remover a camada capsular fibrosa translúcida da superfície exposta. Raspe o mais superficial 0,5 mm da superfície exposta do rim para remover o restante da cápsula.
- Use a lâmina #15 para dissecar uma pirâmide invertida de tecido da área congelada, aproximadamente 2 mm3 no tamanho. Recuperar o prato de 60-mm contendo apenas DPBS e colocar o prato limpo a pirâmide do tecido. Descarte o restante do rim.
- Diminua a ampliação de 1.5-2.0 X para o resto da dissecação. Usando dois instrumentos de pinça hemostática-agulha como instrumentos de corte, fatie o fragmento de tecido em pedaços progressivamente menores até que os segmentos de tecido são menor ou igual ao diâmetro das dicas de agulha. Um tecido renal 2 mm3 no tamanho produzirá mais de 50 segmentos uma vez completamente dissecados.
- Mova o prato de 60-mm com segmentos renais para o capô de cultura de tecidos. Remova DPBS com pipeta de 1000 µ l. Adicione 5 mL DMEM, suplementado com 10% soro Fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
- Cultura por 3 dias a 37 ° C em uma incubadora ou implante em construções de celulares imediatamente.
3. renal segmento construção celular fabricação
- Cultura normal humanos fibroblastos dérmicos (NHDF) e humanas adiposas microvasculares células endoteliais (HAMEC) durante várias semanas obter a 7,2 x 105 fibroblastos e 1,8 x 105 células endoteliais por construto desejado. O capuz de cultura de tecidos, propagar a relação apropriada dos fibroblastos, células endoteliais (4:1) para poços de forma cilíndrica em agarose moldes para formar o andaime livre pre-vasculares endotelial-fibroblasto construções (SPEC), conforme descritas por Czajka et al 19.
- Obter um hemostat esterilizado, agulha de 30½ G e uma espátula estéril com extremidade plana.
- Remova a maioria dos meios de comunicação da placa de 60-mm contendo segmentos renais, tomando cuidado para não aspirar e remover os segmentos renais.
- Equipe as lupas cirúrgicas para visualizar a implantação dos segmentos.
- Raspe o fim da espátula suavemente ao longo do fundo do prato 60mm para obter segmentos de 10-15, espalhar-se uniformemente ao longo da ponta da espátula. Coloca a ponta da espátula tão próxima quanto possível para o lábio do poço onde o SPEC foi semeada.
- Use um instrumento de agulha pinça hemostática-30½ G na outra mão para mover cada segmento individual desde a ponta da espátula para a borda do poço. Mova cada segmento para o bem usando a ponta da agulha até ligeiramente submerso na suspensão celular previamente semeada.
- Cultura de segmento renal-SPEC em 2:1:1 relação de meio de mutilação genital feminina-2/EGM-2/DMEM (total de volume de 2,5 mL). Mudar a cada 24 h de meios de cultura por 3 dias. Remover as construções de moldes em 72 h e corrigir ou congelam para processamento.
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Representative Results
O protocolo descrito produz aproximadamente 50 segmentos renais por seção de3 mm 2 piramidal do tecido renal. Os segmentos renais que foram processados e fotografados tem componentes tubulares e glomerulares em proporções diferentes (ver Figura 2). Os segmentos intactos foram submetidos a um ensaio para determinar a viabilidade de diferentes segmentos de uma vez a cada 24 horas durante três dias. Verde-fluorescente calceína-AM está presente com atividade de esterase intracelulares, indicativa de células vivas. Vermelho-fluorescente ethidium homodímero-1 é visto com perda da integridade da membrana plasmática. Embora esses segmentos são estruturas intactas, tridimensionais, penetração significativa do ensaio é apreciável com microscopia confocal (ver Figura 3).
Segmentos adicionais foram caracterizados para a uniformidade de tamanho usando o mesmo ensaio da viabilidade celular. Usando lâminas de vidro com depressões, segmentos foram colocados sob a tampa desliza sem força mecânica, colocada em qualquer dimensão dos segmentos. Livre flutuante, os segmentos eram imagens 30 minutos após a colocação no ensaio de viabilidade/toxicidade celular. Uma z-projeção com tamanho de passo de 10 µm foi tirada através do segmento inteiro. As maiores dimensões 'X' e 'Y' foram obtidas e registradas. A dimensão de 'Z' foi obtida calculando a distância do primeiro ao último fluoróforo visível. Dado que os segmentos são mais ou menos cúbicos, uma medida de volume cúbico simples foi obtida e plotada comparar 10 segmentos selecionados aleatoriamente de um microdissection experimento. Volume de (300 µm)3 -alvo = 0,027 mm3 é mostrado com um marcador vermelho no histograma(Figura 4). Medições representativa 'X' e 'Y' são mostradas na Figura 4,B. Embora haja exceções, existem muitos segmentos perto do volume de destino. Repita a experimentação tem mostrado resultados consistentes (n = 20). As medições crus (não mostradas aqui) mostram que na grande maioria dos segmentos, há pelo menos uma dimensão de 200-300 µm de medição. Isto tem implicações importantes para as limitações de difusão.
Os segmentos renais são incorporados em construções de andaime-free endotelial-fibroblasto e cultivados por 3 dias. Os segmentos renais incorporam com as construções celulares para formar estruturas intactas por dia 3 (consulte a Figura 5A). As construções de mantenham sua rede de pre-vascular endotelial, mostrado pela rotulagem com von Willebrand Factor (Figura 5E). No entanto, não parece que a rede invade o material celular renal. Células epiteliais renais são rotuladas com a citoqueratina-18 (Figura 5B, verde). Essas construções foram incubadas com FITC-rotulado albumina (Figura 5-C, cinza) a fim de testar em vitro funcionalidade renal. Enquanto houver residual albumina encontrada longe de segmentos de tecido renal incorporado, existem "pontos quentes" na área das células epiteliais tubulares renais, os conhecidos para ocupar a albumina que atravessa intra-luminally. Isto é pensado para representar a recaptação de albumina na construção celular segmento renal.
Figura 1 : Fotografias de representante da nefrectomia e Renal segmentar Microdissection. Um rim murino é removido, enxaguado e colocado em um prato de 60 mm e mudou-se para a fase de Microscópio Estereoscópio. O diâmetro da ponta da agulha é usado para guiar a dissecação. Hemostatos são anexados para dicas para os instrumentos de dissecção de agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Segmento Renal Microdissected. Os segmentos renais microdissected contêm diferentes proporções de glomérulos (canto inferior esquerdo, estrutura basophilic) e túbulos (restante da imagem) em seu arranjo nativo. 10 X imagem, barra de escala, conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Viabilidade de segmento renal. Os segmentos renais microdissected contêm porções de tecido vivo e morto. Predominantemente, os segmentos estão vivendo e permanecem assim na cultura em 72 h. nota que segmentos diferentes foram usados para os pontos de tempo diferentes, como o ensaio da viabilidade em si é tóxico para as células. 10 X de imagens, barras de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Segmento renal Volume uniformidade. (A) volume cúbico em mm3 do experimento uma dissecação do segmento (n = 10). Segmentos individuais são representados por pontos de azul, em comparação com o ponto vermelho do alvo (alvo volume 0,027 mm3). (B) representante X e Y dimensão medições de ensaio ao vivo-morto, imagem de X 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Engenharia de tecidos andaime livre Renal do segmento construção. (A) imagem mesclada mostrando a incorporação de segmentos renais as especs. (B) a citoqueratina 18-positivo renal tubulares células epiteliais (verde). (C) FITC-rotulado de albumina. (D) mancha de Hoescht para núcleos. (E) von-Willebrand positividade de fator (vWF) destacando a rede prevascular. 10 imagens X, barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Métodos usados para projetar o tecido renal vivo construções variam bastante no que se refere o tipo de células e biomateriais utilizados e em muitos casos, estão desatualizados ou não bem caracterizadas na literatura7. Enquanto muitos estão usando células-tronco abordagens ou sintetizando os componentes individuais da arquitetura renal isoladamente, é a perspectiva de recriar artificialmente um órgão inteiro com mais de 26 tipos diferentes de células diferenciadas de suspensões celulares esmagadora de considerar21. Isto é provavelmente porque os outros mudaram para abordagens usando segmentos de tecido renal em aplicações de engenharia de tecidos. Conforme descrito acima, trabalho anterior foi feito no isolamento dos segmentos renais para propagação em PGA andaimes16. No entanto, a metodologia utilizada para descrever o isolamento dos segmentos foi descrita em detalhe e os segmentos não foram cultivados por qualquer período de tempo para avaliar a viabilidade. O método descrito aqui, juntamente com o uso do ensaio viabilidade celular, mostra que, no mínimo, porções dos segmentos renais são manter viabilidade para a marca de 72-h, que não foi descrita antes. O método também tem a vantagem de produzir segmentos com dimensões bastante previsíveis. Além disso, esses métodos fornecem uma abordagem clinicamente traduzível aumentando falhando a função renal, principalmente, demonstrando um método viável para isolamento de segmentos de tecido renal primário de órgãos que seriam caso contrário serão descartados.
Ao desenvolver o método, maiores desafios foram, em primeiro lugar, identificar um objeto estéril do tamanho apropriado e segundo, manter a esterilidade, como o procedimento envolvido muitos passos fora do capô de cultura de células. Dicas de agulha 30½ G provaram para ser útil medida bem como dispositivos de dissecação. Esterilidade foi um desafio no início da experimentação, principalmente relacionado com a instalação cirúrgica e pelo controladora de murino.
Limitações do procedimento estão relacionadas com a natureza tridimensional dos segmentos de tecido renal. Em uma vista ao microscópio, as dimensões do segmento podem parecer ser mais ou menos o tamanho do diâmetro da agulha, 0,260 mm. No entanto, o Z-dimensão não é visível em um estereoscópio. O microdissection é feito à mão, que em si é outra limitação. No futuro, padronização robótica seria o ideal. Se a porção piramidal3 de 2 mm de tecido renal manteve-se na orientação correta durante a dissecção, dissecando sair intactos néfrons não seria insondável. Finalmente, comparando essas construções ao pâncreas bio-artificial, na qual ilhéu células foram incorporadas na especificação, um deve reconhecer diferenças chaves20. O rim é funcionalmente e arquitectonicamente único do pâncreas e indiscutivelmente mais complexa. Além disso, células das ilhotas são apenas um subtipo de célula funcional dentro do pâncreas, em oposição ao conglomerado de células funcionais isolados com segmentos renais neste método. Com arquitetura e especificamente direcionalidade jogando um papel tão grande na função do rim e particularmente a filtração, a falta de orientação uniforme dos segmentos dentro da construção é uma fraqueza adicional desta metodologia.
Investigação em curso destina-se a avaliação do segmento renal e funcionalidade de construção renal, para esclarecer a extensão a que está ocorrendo a absorção da albumina e avaliar outras funções renais. Futuro das experiências com animais que envolvem a implantação das construções renais na parede da bexiga. Incorporando a construção nessa estrutura corporal altamente vascular iria permitir rápida anastomose bem como eliminam a necessidade de um sistema de coleta, com filtrado excretando diretamente para a bexiga. Considerando que em vitro funcionalidade dos tecidos renais é extremamente limitada, em vivo testando é vital. Os testes apenas em vitro atualmente relatados na literatura estão centrados em torno de albumina captação e eritropoietina expressão17,22. Esses segmentos vivos do tecido renal intacto em sua arquitetura nativa incorporado em construções com redes endoteliais primitivas, que não dependem de qualquer estrangeiros biomateriais, prometem mostrar em rumo a substituição de tecido renal funcional, biocompatível .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
NIH institucional formação pós-doutoral Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
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